四大家鱼微卫星标记的筛选及其在物种鉴定中的应用.ppt

四大家鱼微卫星标记的筛选及其在物种鉴定中的应用 摘 要 采用132对微卫星(SSR)引物分别对四 大家鱼基因组DNA进行PCR扩增筛选,共 获得12个特异性标记可作为四大家鱼 的鉴定位点,其中青鱼6个(HL13、BL12、Q3214、Q3191-1、hljy2526、Q3205)草鱼3个(Q3205、C3210、C41926)鲢鱼 3个(hljy2526、L718-2、L30814)鳙鱼 2个(Y11534、Y666)。用这些微卫星标 记对2006年肇庆江段5-6月份采集的漂 流性仔稚鱼（酒精保存样本）进行四 大家鱼的识别，结果表明四大家鱼 在 5、8月份所占的比例最大分别11.81% 和22.8%，9月份次之,6、7月份比较少；在总量上，草鱼最多，青鱼最少，鉴定结果与形态鉴定基本一 致，说明采用微卫星标记进行种类鉴定是可行的。 青鱼、草鱼、鲢鱼和鳙鱼原是我国特有的鱼类，最早作为驯养种类故有“四大家鱼”之称。四大家鱼在我国具有分布广、生长快、食性广、抗病力强、肉味鲜、易养殖等特点，是我国淡水养殖和捕捞的主要对象。近年来，由于水利工程建设、环境污染、过度捕捞等诸多因素，使四大家鱼的天然产量急剧下降，四大家鱼的资源状况直接影响着我国淡水渔业的持续发。为此，有必要对四大家鱼的早期资源展开调查。 对四大家鱼早期资源进行调查，种类鉴定是最基础也是最关键的一步，但是仔鱼标本经甲醛或酒精固定后，可能会变色或褪色，因此使仔鱼种类鉴定受到很大的限制，再加上人为因素的影响，会给鉴定结果带来偏差。微卫星标记具有多态性高、简单的孟德尔遗传方式、共显性等位基因等优点，是解决上述问题的有效方法。 Morgan等在贝类的鉴定中,利用位点在不同物种中扩增条带的不同从而将贻贝从其他物种中区分出来, 宋红梅等利用77对微卫星引物对奥利亚、尼罗和橙色莫桑比克3种罗非鱼基因组DNA进行PCR 扩增 ，筛选出17个微卫星鉴定位点，从而将这3种罗非鱼区分开来。本文通过获得四大家鱼的特异性微卫星标记，重在建立四大家鱼的分子识别技术，并将其应用到仔稚鱼的鉴定中，从而获得四大家鱼在西江肇庆江段的种群组成与时空的变化关系，为四大家鱼资源状况评估及渔业管理提供科学依据，对把握渔业资源数量变动具有重要的意义。 1、材料与方法 1.1、试验材料 青鱼60尾：养殖群体30尾采自桂江增殖放流样本，野生群体各,15尾分别采自西江梧州及北江西牛镇； 草鱼96尾：养殖群体36尾采自贺江南丰，野生群体各20尾分 别采自西江桂平、梧州及北江西牛镇；鲢鱼80尾：养殖群体20尾采自广东顺德，野生群体各,30尾分别采自西江梧州及北江清远；鳙鱼70尾养殖群体20尾采自广东顺德，野生群体各25尾分别采自西江梧州及北江清远。上述样品均于2009年11月采集，均为-20℃无水乙醇固定的鳍条。 鱼苗：于 2006年用定置网具在肇庆江段定点采集的漂流性仔鱼样本，经乙醇固定后置于室温避光保存。 1.2、试验方法 1.2.1基因组的提取 采用传统的酚氯仿法，稍作修改，提取四大家鱼的鳍条基因组DNA，用紫外分光度计检测DNA样品的浓度和纯度，用 ddH2O将DNA稀释至50ng/μL ，置于-20℃保存备用。 鱼 苗 的 消 化 将 试 验 鱼 苗 用 缓 慢 漂 洗 次然后将整尾鱼苗置于 的 溶 中 水浴消化 裂解完毕后 加入 体积 的 涡 旋 混 匀 离 心 取上清作为 反应的模板室温静置保存 微卫星引物的获取与合成 从 和 下载有关四大家鱼的 或 序列 经 搜 索获 得 草 鱼 条 包 含 的 序 列鲢 鱼 包含 的 序列再经 程序比对去 重复序列选取其中一部分序列 采用 软件设 引物 对并从文献 中下载有关四大家鱼的引 对引物均由广州英俊生物公司合成 扩增及电泳检测 反 应 体 系 为 上下游引物 各 聚 合 酶 模 板 反 应 程 序 为 预变性 变性 退火 延伸 个循环 延伸 扩增产物在 的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测 电泳后银 染及显色 微卫星位点的初步筛选及扩大群体的确定 以 青 鱼草鱼鲢鱼鳙鱼各 尾包括野生群体和养殖群体 的基因组 为模板进行微卫星引物筛选 先筛选四大 家鱼特异的单态性标记 扩增 效果重复性好 带型清晰明 亮的引物 并进一步扩大群体初步确定鉴定四大家鱼的 微卫 星位点考虑到微卫星引物的通用性 然后再 根据肇 庆江段同期形态学鉴定结果中出现的种类对所作的标记 加以验证 最终选择在其他鱼类中没有任何扩增产物的 标记作为鉴定标记 仔鱼待检样本的抽取与统计分析 鱼 苗 总 数 的 计 算将整瓶鱼苗标本从酒精中取出 去掉杂 质及形态上可 识别的较大个体 用滤纸吸干 表面的乙醇 称其总重并计 作 随机选取适量样本 记作 称重并记