RNAi技术及应用1.doc

RNAi技术及应用 班级：生工092 姓名：王友超 学号：2009030318 电话  RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(doublestrandRNA，dsRNA)导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失，这一过程属于转录后基因沉默机制(posttranscriptionalgenesiliencing，PTGS)范畴。RNAi广泛存在于生物界，从低等原核生物，到植物，真菌，无脊椎动物，甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象，只是机制也更为复杂。干扰性小RNA(smallinterferingRNA，或shortinterferingRNAs，siRNA)是RNA干扰作用(RNAi)赖以发生的重要中间效应分子.siRNA是一类长约21～25个核苷酸(nt)的特殊双链RNA(dsRNA)分子，具有特征性结构，即siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基.此外，每条单链的3′端均有2～3个突出的非配对的碱基RNAi的主要过程是，dsRNA被核酸酶切割成21～25nt的干扰性小RNA(siRNA)，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子.细胞中dsRNA的形成是RNAi的第一步.细胞中dsRNA可通过多种途径形成，如基因组中DNA反向重复序列的转录产物；同时转录反义和正义RNA；病毒RNA复制中间体；以及以细胞中单链RNA为模板由细胞或病毒的RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)催化合成dsRNA等.在线虫(C.elegans)可以直接注射dsRNA或把线虫浸泡在含dsRNA溶液中等方式引入外源dsRNA，还可以通过喂养表达正义和反义RNA的细菌获得dsRNA.现已初步阐明RNAi的作用机制.RNAi的第一步是，dsRNA在内切核酸酶(一种具有RNaseⅢ样活性的核酸酶)作用下加工裂解形成21～25nt的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA，即siRNA.果蝇中RNaseIII样核酸酶称为Dicer.Dicer含有解旋酶(helicase)活性以及dsRNA结合域和PAZ结构域.已发现在Arabidopsis，C.elegans，Schizosaccharomycespombe以及哺乳动物中也存在Dicer同类物.RNAi的第二步是，由siRNA中的反义链指导形成一种核蛋白体，该核蛋白体称为RNA诱导的沉默复合体(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)，由RISC介导切割靶mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而达到干扰基因表达作用.RISC由多种蛋白成分组成，包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA链搜索活性等.线虫C.elegans中的MUT7(一种RNaseD样蛋白)可能是一种3′5′外切核酸酶.此外，PAZPPiwi蛋白家族成员可能是RISC中的构成组分，如Arabidposis中的AGO1；N.Crassa中的QDE；C.elegans中的RDE1等，以上这些蛋白与翻译因子eIF2C同源.研究进一步揭示，ATP在siRNA介导的RNAi中具有重要作用.较长dsRNA向siRNA的转变要有ATP参与.siRNA与蛋白因子形成一个无活性的约360kD的蛋白PRNA复合体；随之，siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA复合体(RISC)，此步具有ATP依赖性.RISC活性复合体对靶mRNA的识别和切割作用，这一步可能不需ATP参与.此外，ATP使siRNA5′端带上磷酸分子，且对siRNA的功能具有重要作用.上述过程中siRNA双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变，因为siRNA双链体与细胞裂解物、ATP等孵育后再除去ATP及其它辅助因子，含有siRNA的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA分子siRNA可作为一种特殊引物，在RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)作用下以靶mRNA为模板合成dsRNA，后者可被降解形成新的siRNA；新生成的siRNA又可进入上述循环.这种过程称为随机降解性多聚酶链反应(randomdegradativePCR).新生的dsRNA反复合成和降解，不断产生新的siRNA，从而使靶mRNA渐进性减少，呈现基因沉默现象.RdRp一般只对所表达的靶mRNA发挥作用，这