微核监控技术在实验的根尖.doc

实验四 蚕豆根尖微核监测技术（VMT） 一、实验目的 学习如何利用高等植物间期体细胞遗传检测系统以监测环境中的致突变物。 二、原理 在细胞分裂早期，若受到有害理化因子的攻击，使染色体发生断裂，产生染色体片段。在这些片段中，有些可能重新愈合恢复正常，随细胞分裂进入子细胞，有些则由于缺乏着丝点，不能移向细胞的极部而变成圆球体，像卫星一样分布在主核的周围，这便是微核，由于染色体片段的大小和数量不一，所以微核的大小和数量也不相同。而蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量多，因而对诱发物的反应敏感，通过显微镜下的观察和计数，便可监测环境污染。 三、器材与试剂 显微镜、温箱、恒温水浴箱、冰箱、手揿计数器、解剖盘、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、试剂瓶、烧杯等显微镜压片实验用具。 试剂 1.5N HCl、45%醋酸、卡诺氏液（无水乙醇3份加冰醋酸1份配成，固定根尖时随用随备）、Schiff试剂、SO洗涤液。 四、操作步骤 1、蚕豆浸种催芽 （1）浸种：将当年或前一年的松滋青皮豆种子按需要量放入盛有有自来水的烧杯中，置25℃温箱内，浸泡20~30小时，此期间至少换水2次，换用的水最好事先置于25℃ （2）催芽：待种子吸胀后，用纱布松松包裹置解剖盘内，保持温度，在25℃的温箱中催芽12~24小时。待种子初生根露出2~3mm时，再选取发芽良好的种子，放入铺有薄层温脱脂棉的解剖盘内，仍置入25℃的温箱中继续催芽，注意保护湿度。再经24~36h，种子大部分初生根长至2~3cm 2、被监测液处理根尖 （1）每一处理选取6~8粒初生根尖生长良好，根长一致的种子，放入盛有被测液的培养皿中，被测液浸泡住根尖即可，用自来水处理作对照，方法相同。 （2）处理时间4~6h。 3、根尖细胞恢复培养： （1）将处理的种子，用自来水浸洗8次，每次2~3min。 （2）洗净后的种子再放入新铺好湿脱脂棉的解剖盘内，按前述培养条件使根尖细胞恢复22~24h。 4、固定根尖细胞 （1）将恢复后的种子，从根尖顶端切下1cm长的幼根放入青霉素空瓶中，加卡诺氏固定液固定24h。 （2）固定后的幼根如不及时制片，可换入70%的乙醇中，置4℃的冰箱内保存备用。 5、Feulgen染色 （1）固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸馏水浸洗2次，每次5min。 （2）吸净蒸馏水，再加入5N HCl将幼根泡住，连瓶放入28℃水浴锅中水解幼根25min左右，至幼根被软化即可。 （3）用蒸馏水浸洗幼根2次，每次5min。 （4）在暗室或遮光条件下加Schiff试剂，每瓶用量以淹没幼根液面高出2mm为好。 （5）除去染液，用SO2洗涤液浸洗幼根2次，每次5分钟。 （6）用蒸馏水浸洗幼根1次，5min。 （7）将幼根放入新换的蒸馏水中，置4℃的冰箱内保存，可供随时制片之用。 6、制片 （1）将幼根放在擦净的载玻片上，用解剖针截除根冠区，截留下1mm左右的根尖分生区。 （2）滴上少许45%的醋酸溶液，用解剖针将根尖捣碎。 （3）加盖一清洁的盖玻片，注意不要有气泡。 （4）再在盖玻片上加一小块滤纸，轻轻敲打压片。 7、镜检及微核识别标准 将制片先置显微镜低倍镜下，找到分生组织区细胞分散均匀，膨大、分裂相较多的部位，转到高倍镜（物镜40×）下进行观察。 微核的识别标准： 凡是主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。 小核着色与主核相当或稍浅。 小核形态可以是圆形、椭圆形、不规则形。 每一处理观察3个根尖，每个根尖计数1000个细胞中的微核数。 五、实验数据的统计处理和污染程度的划分 将微核观察记载表上所得的数据，按如下步骤进行统计学处理。 （1）各测试样品（包括对照组）微核千分率（MCN‰）的计算： ‰=‰ （2）如果被监测物样品不多，可直接用各样品率平均值与对照比较，从差异的显著性判断水质污染与否。 （3）如被监测的样品较多，可先用方差分析看各采样点所出现的率平均值和对照的差异显著性，如差异显著，还可进行各采样占微核差异显著性的多重比较，看被检测样品率平均值差异显著性的分组情况，以归纳划分这些不同采样点不同级别的污染程度。 （4）如采用已筛选出的、又专门隔离栽培，无污染的松滋青皮豆作实验材料，并按规范标准实验条件，其监测样品污染程度的划分，可不用上述两种统计处理方法，而直接采用如下标准： = 1 \* GB3 ①‰在10%以下为基本没有污染； 10‰-12‰区间为轻污染； 10‰-30‰区间为中污染； 10‰以上为重污染。 = 2 \* GB3 ②污染指数判别：此方法可避免应实验条件等因素带来的‰本底的波动，故较宜适用。 污染指数（PI）= 污染指数在0-1.5区间为基本没有污染； 1.5-2区间为轻污染； 2-3.5区间为中污