实验三 细菌的分离培养及移植.ppt

实验三 细菌的分离培养及移植 两个概念： 在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。 分离：从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法； 纯培养：一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。 实验目的： 1 掌握细菌分离培养的基本要领和方法 2 掌握挑菌、纯培养及移植技术 3 了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状 实验材料： 球 1 菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的混合培养肉汤等； 2 培养基：普通肉汤、普通琼脂斜面、普通琼脂平板 3 器械：剪刀、记号笔、酒精灯、接种环 一 需氧型细菌分离培养法 1. 平板划线分离法 菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离。 此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，以求得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。 ? 划线培养时注意问题： 左手持皿，用左手拇指、食指及中指将平皿揭开约呈20°的角度(图1)； 右手持接种环，灼烧冷却后从混合培养肉汤中取少量涂布于培养基边缘，开始划线(图2)； 划线前先将接种环稍稍弯曲，使之易与琼脂面平行，不致划破培养基； 划线中不易过多的重复旧线，以免形成菌苔； 接种完毕，在皿底作好标记（菌名、日期、接种者等），平皿倒扣，置于37℃培养。 图2 连续划线法 区划线法 图1 划线分离示意图 2.纯培养的获得与移植法 ---琼脂斜面分离法 将37℃下培养24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落，镜检不含杂菌，即用接种环挑取单个菌落移植于琼脂斜面培养，所得的培养物即为纯培养物。 图3 斜面接种时试管的拿法 图4 斜面接种时无菌操作的程序 左手斜持菌种管和被接种琼脂斜面管，使管口相互并齐，管底部放在拇指和食指之间，松动两管塞子，以便接种时易拔出（图3）。 右手持接种棒，火焰灭菌后，用右手小指和无名指并齐同时拔出两管塞，将管口进行火焰灭菌，使其靠近火焰。 将接种环深入菌种管内，先在无菌生长的琼脂上接触使之冷却，再挑取少许细菌后拉出接种环立即放入另一斜面培养基上，勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部。 从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌，塞好棉塞，灭菌接种环，作好标记，置于37℃温箱培养。（图4） 2.1 两试管间的斜面移植 2.2 平板到试管斜面移植 手执接种棒，火焰灭菌，左手打开平皿盖，将接种环置于平皿盖上使之冷却； 挑取可疑的菌落，左手盖上平皿盖后立即取斜面管，深入斜面管中，从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止； 管口通过火焰灭菌，塞好棉塞，灭菌接种环，作好标记，置于37℃温箱培养。 当组织病料中含病原菌少，或有抗菌药残留时，用琼脂斜面或平板分离法可能无菌落长出，为提高由病料中分离培养细菌的机会，这时可以无菌操作剪取一小块病料直接投入肉汤，经37℃培养，在肉汤中长出细菌后，观察其在液体培养基上的生长表现，再用琼脂斜面或琼脂平板分离。 3.营养肉汤增菌培养法 4.穿刺培养法 半固体移植多用穿刺法接种。 方法基本与纯培养接种相同，不同的是用接种针挑取菌落，垂直刺入培养基内。从培养基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。 5.倾注培养法 取三支预先准备的普通琼脂培养基试管，加热融化，冷至约50℃用火焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第一管内，充分摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以同样方法自第二管移种至第三管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于37℃温箱内培养24h。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。 6.芽胞需氧菌分离培养法 如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于80℃水浴箱中维持15～20分钟，再进行培养。材料中若有带芽孢的细菌仍可存活而生长繁殖，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。 7.利用化学药品的分离培养法 (1)抑菌作用: 有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另外一些细菌没有抑制作用，所以可利用这种特性进行细菌的分离。 (2)杀菌作用: 将病料如结核病料用15％硫酸溶液处理，其他杂菌均被杀死，而结核杆菌因具有抗酸性而存活。 (3)鉴别作用: 利用细菌对某种糖的分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别某种细菌。 8.通过实验动物分离法 被检病料中疑有某种病原菌存在，将病料无菌取出，无菌研磨后加3～5倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下或静脉）入易感实验动物，待实验动物死后，取其脏器，常可分离到