ERCC1mRNA表达水平基因检测标准操作规程.docxVIP

目的：规范ERCC1mRNA表达水平检测（荧光定量PCR）操作流程，保证检测结果准确性。项目名称：ERCC1mRNA表达水平检测。检测方法：荧光PCR。方法原理：PCR方法结合荧光探针的体外扩增和检测技术。仪器：博日荧光定量PCR扩增仪。操作步骤：样本RNA提取(样本室)根据《临床标本采集、验收、拒收标准操作规程》接收合格的临床检测样本（同一患者的正常组织样本和肿瘤组织样本各一份）。从试剂盒中取出组织RNA提取需要用到的试剂, 室温融化后，2000rpm离心10sec；参照《组织样本RNA提取标准操作规程》提取正常组织样本和肿瘤组织样本的RNA。提取的RNA样本需要在24小时内进行逆转录操作，否则需置于-80℃保存。RNA提取后剩余的组织样本置于-80℃保存，备查。样本RNA的逆转录取出ERCC1-RT-PCR反应液和引物，按要求稀释溶解引物，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。参考根据《RNA逆转录标准操作规程》设计针对ERCC1基因的RT-PCR扩增。根据RNA样本数，确定RT-PCR扩增反应管数，按5.2.4表计算反应混合液的用量，分装入每个PCR反应管中，振荡混匀，2000rpm离心10sec后，49μl/管；注意避免产生气泡，盖好管盖后经传递仓转移至样本处理区。（试剂准备室）单管RT-PCR反应液配制（50ul体系）： 2×mRNA Selective PCR Buffer 25ul MgCl2 10ul dNTPs/analog Mixture 5ul RNA酶抑制剂 1ul 逆转录酶 1ul DNA聚合酶 1ul 上游引物F 1ul 下游引物R 1ulddH2O 4ul 样本 1ul加样（样本处理室）PCR反应管中分别加入不同样本提取的DNA模板各1μl（在生物安全柜中进行操作）；应将样本直接加入反应液内，避免样本粘附在管壁上，盖紧管盖充分混匀后低速离心10sec，转移至扩增区。RT-PCR扩增反应(扩增室)将反应管排好放入PCR扩增仪内，记录样本摆放顺序；反应循环条件设置（参照《博日PCR仪使用、维护、校准标准操作规程》）： 50℃ 15min 1cycle 85℃ 1min 45℃ 1min 25cycle 72℃ 1min 反应体系为50μl。反应结束后，取RT-PCR反应液（5～10ul）进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物为目标DNA片段，-20℃保存。荧光定量实验扩增试剂准备（试剂准备室）从试剂盒中取出ERCC1荧光定量PCR反应液、Taq酶、引物、探针，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec；确定检测反应管数为n（n＝样本数＋4管不同浓度梯度的标准品＋阴性对照）按5.3.1.3表计算反应体系(40ul)各试剂的用量，加入一适当体积离心管，充分混匀，2000rpm离心10sec后分装入每个PCR反应管中，38μl/管；注意避免产生气泡，盖好管盖后转移至样本处理室。单个检测反应体系配制表：ddH2O 27.2ulPCR buffer 4ul dNTPs 4ul Primer F 0.8ulPrimer R 0.8ul特异性探针