林仲旸－微生物群落基因指纹分析 - 生物化学与分子生物学.ppt

微生物群落基因指纹分析—研究现状与未来展望 林仲旸摘要 微生物生态学常利用核糖体RNA作为一种分子技术来鉴定微生物种群，其中一种策略就是克隆从周围环境获得的PCR产物来检查微生物群落的多样性，而不需进行培养。虽然这种方法很成功，但却不适合用来研究微生物群落复杂的动力学，例如微生物群落对电解质的耐受，季节波动的影响，环境变化的影响。因此，基因指纹分析技术是一种更好的方法，在此我将展示当前基因指纹技术在微生物生态学的应用并展望未来的前景。 基因指纹分析技术的意义 微生物通常很小，外部特征也不显著，无法通过形态学去分类。 自然界中99%的微生物是无法被分离 。 为了对微生物多样性执行生态系统机能所发挥的作用更好地理解 ，一种能弥补传统微生物测定法的不足的技术是很必须的。 基因指纹分析技术基于各种独特的核苷酸物理分离片段，能描绘出微生物群落的结构轮廓。 最重要的是，这种方法能够同时分析多个样品，因此能够比较不同环境中微生物群落的遗传多态性，还能随时间变化研究单个群落的习性。 低分子量RNA指纹技术 该基因指纹技术的用于描绘低分子量RNA(5S 核糖体RNA；转运RNA)已有10年多了，这项技术通过直接从环境样品中提取总RNA，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。显影后可将图谱扫描然后储存在数据库中方便比对。 到目前为止，克隆16S rDNA的PCR扩增产物是检测微生物多样性和鉴定混合的微生物群落种类构成最成功的方法。 DGGE 和 TGGE 变性（温度）梯度凝胶电泳法，将收集到的混合微生物基因组DNA和通过特异引物获得PCR产物的混合物，在含有线性梯度的DNA变性剂（或梯度温度条件下）的聚丙烯酰胺凝胶中电泳.不同DNA分子中不同的序列排列影响双链的熔解，因此不同序列的分子分离。 该技术常被用于构建混合群落的基因图谱，研究细胞群落的群体动态和不同基因在混合群落的表达，所以可以以此来监视增殖培养，比较DNA分离方法，屏蔽克隆库的重复，测定rRNA 操纵子的微观不均一性。该技术最重要的一点是条带可以保存在胶中，随后的排序可以显示群落成员种系发生的信息. SSCP 单链构象多态性技术通过特异引物扩增DNA片段，将PCR产物变性后直接在非变性胶中电泳。 分离基于单链DNA的不同的折叠构象，因此影响电泳迁移率。 Lee 和 coworkers用此技术来研究天然细菌群落的结构和多样性。 Schwieger 和 Tebbe 用PCR-SSCP来分析不同植物根际的微生物群落。 RAPD和DAF 随机扩增多态性DNA（RAPD）被用于跟踪不同土壤微生物群落对2，4—D的反应。Breen et等用一个相似的方法，名字叫做DNA扩增指纹法（DAF） ，来比较不同生物反应器中的微生物群落，以及一个生物反应器中的群落变化。这两种方法都用来5-10碱基的随机引物，这些随机引物在基因组DNA的不同部位复性，使PCR产物分生出不同的长度。产物在琼脂糖胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行分离，然后用EB染色或银染显示出条带。 Bb-PEG 电泳 双苯酰亚胺--聚乙烯二醇电泳是一种简单和快速的电泳方法，用以检测不同的细胞培养和不同环境中样品基因的PCR产物的序列变化。电泳在含有双苯酰亚胺配基的琼脂糖凝胶中进行，长链和PEG交联。双苯酰亚胺约束AT富集的序列。高A+T含量的DNA分子比低A+T含量的DNA分子在胶中所受阻力更大，因此能够分离各种片段。 RFLP 和 ARDRA 限制性片段长度多态性和扩增rRNA片段限制性分析都能用于微生物群落的特征分析。将16S rDNA 片短用通用引物进行PCR扩增，再用限制性酶消化，然后通过琼脂糖或聚丙烯酰胺胶电泳，最后进行显色，即可进行分析。 Martinez-Murcia 等用RFLP分析16S rDNA 片段的PCR扩增产物来评估多盐池塘的原核生物的多态性。 T-RFLP 这种技术跟RFLP很相似，利用荧光标记PCR产物。这种产物在进行PCR扩增的时候用一种带荧光的引物使尾端带有标记。在接下来的测定中，扩增的基因将被限制性酶消化，让后在DNA自动测序仪中进行检测。只有带有荧光标记的限制性片段即末端限制性片段才能被检测出来。Avaniss-Aghajani 和 co-workers最先运用这种方法来鉴定复杂混合物中的不用细菌。 讨论 基因指纹技术用于研究不同微生物群体的遗传差异、环境变化之后对细菌群落的变化的监视既简便又快速。这些技术都能用于描述性技术分析，而且只有几种方法，如LMW RNA指纹、DGGE、SSCP，能通过杂交分析或分离条带的序列分析对群落成员进行进一步的鉴定。基因指纹技术的发展将使的越来越多多工作在微生物生态方面的科学家产生浓厚的兴趣。 谢谢 * * Methods of Mi