观察药物对荷瘤小鼠抑瘤率的影响-厦门大学学报自然科学版.DOC

重组ProTα对肝癌小鼠Treg细胞和NKG2D阳性细胞的影响 陈 炜1,3，周克夫2，栗 华3* 福建中医药大学研究生院，福建 福州，350108；2. 厦门大学环境与生态学院，福建 厦门，361005；3. 厦门大学附属第一医院，福建 厦门，361005） 摘要：为观察不同时期应用重组胸腺素α原（ProTα）对荷瘤小鼠抑瘤率的影响，并对Treg细胞和NKG2D的影响36只KM小鼠随机分成空白组、荷瘤组、药物干预组，H22肝癌细胞皮下移植建立荷瘤小鼠模型，腹腔注射重组ProTα，观察7、14后对肝癌小鼠的抑瘤率，并检测外周单个核细胞中调节性T细胞的比例和NKG2D情况。结果表明：移植瘤7后，重组ProTα干预组和荷瘤组瘤重对比无显著差异。移植瘤14后，干预组瘤重较荷瘤组对比有显著差异。荷瘤14后，荷瘤组较空白组Treg细胞比例升高，NKG2D下调，差异显著。不论是重组ProTα干预14组还是进展期药物干预组，Treg细胞比例均明显降低，NKG2D明显升高，统计学差异显著。由此可见，重组ProTα能够抑制肝癌荷瘤小鼠肿瘤生长，并且早期、长期用药效果更好，相关作用机制涉及下调Tregs数量从而抑制肝癌细胞免疫逃逸，并上调NKG2D提高其介导的抗肿瘤效应。 关键词：重组胸腺素α原肝癌调节性T细胞NKG2D 中图分类号：R 735.7 文献标志码：A 1995年，Sakaguchi等[]发现回输CD4+CD25+T细胞可以阻止裸鼠自身免疫疾病发生，Sakaguchi具有抑制机体免疫功能的命名为调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）。大量研究发现，调节性T细胞广泛存在于各种肿瘤微环境中[]，并且与肿瘤的预后呈负相关[]。张蘋等发现肝癌荷瘤小鼠脾脏、引流淋巴结中CD4+CD25+Tregs比例较对照组升高，且Tregs数量的高低与肿瘤大小呈正相关[]。NKG2D是NK细胞的活化受体，除了NK细胞外，NKG2D还表达于活化的CD8+T细胞、γδT细胞。NKG2D与特异性配体结合，发挥免疫应答和免疫监视作用。目前已知的配体主要是组织相容性复合体MHC）I类和UL16结合蛋白家族，包括MICA、MICB、ULBP1-4等[]，此外，组织相溶性抗原60、视黄酸早期转录因子1也参与NKG2D的免疫调控[]。NKG2D主要表达在受感染细胞和恶性肿瘤细胞表面，健康细胞很少表达。在肿瘤细胞和效应性T细胞表面，Groh等发现NKG2D与可溶性配体MIC结合后发生内化降解，导致效应T细胞抗肿瘤作用减弱[]。Tomohiro等发现在胃癌患者体内，CD8+T细胞表面NKG2D的表达显著下调，并且NKG2D的表达与癌组织的侵润深度呈负相关，进一步的体外实验证实，加入MICA抗体可以阻止NKG2D的下调[]。 α原（Prothymosin α，ProTα的ProTα具有促进细胞增殖的作用，参与细胞凋亡和肿瘤生长的调控。外源性ProTα具有较好的增强机体免疫和抗肿瘤作用，它能够促进IL-2、TNF-α、IFN的分泌，刺激肿瘤特异性T淋巴细胞产生，发挥抗肿瘤作用。我们前期的研究证实[-16]，重组胸腺素α原对于荷瘤及癌性腹水小鼠肿瘤生长和生存周期有较好的改善作用但其对Treg细胞和NKG2D表达的影响尚未。本实验通过早期及进展期用药干预，观察重组ProTα对荷瘤小鼠抑瘤率的影响，并Treg细胞和NKG2D素α原[17]（厦门大学环境与生态学院周克夫教授及厦门伯赛因公司联合提供）、Treg细胞流式染色试剂盒（美国ebioscience）、PE-antiCD314抗体（美国ebioscience）、淋巴细胞分离液（天津灏洋有限公司）、磷酸盐缓冲液（PBS，实验室自配）、流式细胞仪（型号：BD LSRFortessaTM）。 1.3.2 小鼠分组及重组ProTα干预 α[15,17]，并于药物干预7 d、14 d后分别脱脊处死，D进-7组小鼠于移植瘤后第8天开始每只每天腹腔注射注射同等剂量药物，药物干预7 d后处死。空白组小鼠（N）每只每天腹腔注射等体积无菌生理盐水，于14 d后处死。 1.3.3 计算抑瘤率 脱脊处死小鼠，无菌条件下剥离小鼠肿瘤，称取小鼠瘤重，计算抑瘤率，比较小鼠肿瘤大小及抑瘤率。 抑瘤率(％％1.3.4 流式细胞术检测Treg细胞及NKG2D比例无菌条件下分离小鼠脾脏，加入适量培养基研磨，200目筛网过滤，PBS洗涤3次，淋巴细胞分离液分离外周单个核淋巴细胞（PBMC），适量PBS重悬细胞，使细胞浓度约107/m，每个流式上样管中加入100ul准备好的细胞悬液，大概106个细胞，根据说明书加入相应膜表面染色抗体，4 ℃避光孵育，PBS洗涤细胞，于Tregs标记管中加入固定/破膜工作液，避光孵育30 min，洗