4Exiqon公司miicroRNALNA实时定量PCR探针.docVIP

Exiqon公司LNA microRNA的PCR系统 丹麦Exiqon公司的新型miRCURYTM LNA microRNA PCR系统能够快速、精确、灵敏地对microRNA进行定量，它所使用的是基于SYBR Green检测法的microRNA特异的实时定量PCR方法。该系统是由以下三部分组成： miRCURYTM LNA 第一链（First-strand）cDMA Kit miRCURYTM LNA SYBR Green master mix miRCURYTM LNA microRNA引物组 这个系统提供了所有必需的组份，并对实时定量PCR实验的反应体系作了优化，确保对微量样本如10pg的总RNA也能达到很好的效果，可靠的检测底限为10个拷贝的microRNA。这个系统提供了各种高品质的引物组，所有的microRNA引物都能确保获得低背景、高特异性和高灵敏度的结果。 miRCURYTM LNA microRNA的PCR系统主要优点： 灵敏度高 即使样品的总RNA少于10pg，或者只来自一个细胞的总RNA都可用于实验。 可靠的检出少于10个拷贝的microRNA。 线性范围广 可精确定量的线性范围超过8个数量级。 可靠的检测同一样本中高表达和低表达的microRNA。 特异性高 具有单碱基差异的识别能力，能够特异的区分序列相近的microRNA家族成员。 能够区分microRNA成熟体和前体。 重复性好 两次实验之间的相关性超过98%。 完全经过验证的microRNA实验 高品质的基于LNA专利技术的microRNA特异引物组。 快速可靠 简单的两步法实验，能够在三小时内完成。 短PCR引物能够降低引物错配或二聚体形成的风险。 能够对microRNA进行高通量的分析。 快速稳健的聚合酶链反应程序 miRCURYTM LNA microRNA PCR系统结合了LNA专利技术、SYBR Green染料和简单的两步法反应，包括从总RNA中对microRNA进行特异的反转录以及进行实时定量PCR实验。正如下图所示，两步反应所用的都是针对成熟的靶microRNA特异的引物：1）起始的microRNA到cDNA的反转录是由非常敏感且热稳定性良好的反转录酶完成的，2）而后再进行实时定量PCR扩增反应。 图1. miRCURYTM LNA microRNA PCR系统的示意图。第一步：直接从总RNA中，将感兴趣的miRNA通过逆转录过程反转成cDNA模板，这一步所用的是miRNA特异的反转录引物。 第二步：用cDNA模板进行实时定量PCR实验，这一步所用是锚着在miRNA 序列上的LNA增强的引物及反向扩增引物。之后用SYBR Green进行检测。 LNA完善了microRNA的实时定量PCR实验 由于靶microRNA序列很短，所以其PCR引物的设计始终是一个挑战。标准的PCR步骤要求足够长的引物与靶microRNA配对，但在反应中很难避免形成引物二聚体，从而导致高背景。使用LNA增强的短序列引物能够最大限度的减少引物二聚体的形成，microRNA高特异性的退火能够保证在较宽的线性范围内获得极其灵敏的结果。 图1. 对于miR-194和miR-21的检测，用LNA替代的引物对分辨率的提升不明显。分别用DNA引物（蓝色）和LNA引物（灰色）进行检测，无论在敏感性和检测动态曲线上都相差不多，对miR-21来说LNA引物会有一些改善。对miR-26而言LNA引物就能显著的改善结果。特别是miR-215，用DNA引物扩增只得到非常微弱的信号，而改用LNA引物后情况就完全逆转了。人工合成的microRNA背添加到被当作背景的酵母总RNA中。左边的曲线代表对HeLa S3细胞总RNA中的microRNA，进行四次实验的平均值；右边的曲线代表不含有HeLa S3细胞 RNA模板所作的对照。 突出的灵敏度及宽广的线性范围 特定的LNA增强的短序列引物——miRCURYTM LNA microRNA引物组能够在一次反应中可靠的检测10个拷贝的microRNA，具有非常突出的灵敏度。能够完全区分PCR扩增产物和背景信号，线性范围超过了8个数量级。无论低表达或高表达的microRNA都能得可靠的的结果。 图2. 不同拷贝数microRNA的精确定量范围：Has-miR-100（2×108拷贝）被转成cDNA。这些cDNA以10倍梯度被逐渐稀释，从2×109拷贝数到2个拷贝数，用实时定量PCR进行扩增。A. 为扩增曲线 B.标准曲线，显示的是逐渐减少的循环数和microRNA拷贝数之间完美的线性相关，并且证明少于10个拷贝的microRNA都能灵敏的探测到，线性范围达8个数量级。 精确检测一个细胞中的microRNA miRCURYTM LNA mi