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中国农业大学《基因工程》考研精华 基因工程：诞生于20世纪70年代。概念：是在分子水平上进行的操作，指将多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者人工合成基因，按照人们的愿望，严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）细胞中，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。三要素：供体 受体 载体。 基因工程的主要内容：1.目的基因的获取 2.重组体的制备 3.重组体的转化 4、克隆鉴定 5、目的基因的表达 限制性内切酶：是一种能够识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列（4-8bp）并由此处切割双链的核酸内切酶。 1、来源：原核生物 2、性质：在核酸分子链的内部制造切口 3、功能：自身保护作用 （R/M体系：保护自身的DNA不受限制，破坏外源的DNA使之迅速讲解） 影响限制酶活性的主要因素：1、DNA的纯度 2、DNA 的甲基化程度 3、温度 4、缓冲溶液 5、DNA的分子结构 Klenow片段：E.coli DNA聚合酶经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5-3ˊ聚合酶和3-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5-3ˊ外切酶活性。3ˊ断的补平；2、DNA 3ˊ末端标记；3、cDNA第二链的合成。 平齐末端DNA 的连接方法：1、同聚物加尾法 2、衔接物法；3、接头连接发。 双酶切相对单酶切的优点：可保证插入外源片段的方向，防止载体自连，提高重组率。 星号活性：在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。mRNA的分布状态。 3、从cDNA 克隆中，不能克隆到基因组DNA中非转录段序列，不能用于研究基因编码区外调控序列的结构与功能。 cDNA文库:指将某种生物基因组转录的全部mRNA，经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称为该生物基因组的cDNA文库。 cDNA文库的构建：1、细胞总RNA的提取和mRNA的分离 2、第一条cDNA的合成 3、第二条cDNA合成 4、双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体。 CDNA文库的优缺点：优点：1、cDNA以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构，研究有关基因的克隆分离。2、cDNA文库的筛选比较简单易行。 3、每一个cDNA文库都含有一个mRNA序列。这样在目的基因的选择中，出现假阳性的概率就会比较小，因此，阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。4、cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用与基因工程操作。 5、cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能的研究。缺点：1、包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。2、虽然反应mRNA分子结构和功能信息，但不能直接识别基因内含子序列序列和编码区外大调控序列的结构和功能方面的信息。3、相应于高丰度的mRNA的cDNA克隆所占的比例较高，分离比较容易，而相对于低丰度的mRNA的cDNA 的克隆所占比例较小，分离比较困难。 图为克隆的原理：图为克隆又称定位克隆，用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用于目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，在利用此物理图谱通过染色体步移逐步逼近目的基因或通过染色体登陆的方法，最终克隆目的基因并通过遗传转化实验可以研究目的基因的功能。程序：1、建立目的基因的遗传分离群体 2、找到与目的基因紧密连锁的分子标记 3、用遗传图或物理作图将目的基因定位在染色体特定位置 4、构建含有大插入片段的基因组文库 5、以与目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库 6.用阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群 7、通过染色体步移、登陆或跳查，获得含有目标基因的大片段克隆 8、通过亚克隆获得目标的小片段克隆 9、通过遗传转化和功能互补验证，最终确定目标基因的碱基序列。存在的问题：1、需要有精确的遗传图谱 2、遗传图谱上离目的基因很近的分子标记在物理图谱上还相距甚远 3、高等植物基因组极其复杂，存在大量重复序列，在实际操作中会遇到走不动的难题。 感受态细胞：具有摄取外源DNA分子能力的细胞。常用的转化方法：1、原生质体转化法 2、化学转化法 3、电穿孔发 植物基因工程转化的具体方法： 以载体为媒介的遗传转化和外源目的DNA 的直接转化 1、载体介导转移系统 （最常用的转移方法） 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体中并随核染色体复制而表达。 2、外源基因直接导入法 a、化学刺激法 b、基因枪轰击法 c、微注射法 主要选择基因： 新霉素抗性