中国人肥胖基因的克隆序列分析及在大肠杆菌中的表达.docVIP

中国人肥胖基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达【摘要】　目的　克隆中国人肥胖基因，并进行序列分析和在大肠杆菌中表达。方法　采用RT-PCR法从中国人脂肪组织RNA中扩增出肥胖基因(Obese gene)，进行核苷酸顺序分析，并将该基因克隆入原核表达载体，在大肠杆菌中表达。结果　克隆了中国人肥胖基因，其cDNA顺序与已报道的白种人的序列完全一致，并成功在大肠杆菌中获得表达。结论　本项工作为进一步研究肥胖基因在肥胖症和糖尿病等病人中的表达情况及探讨肥胖基因的作用机制打下了基础。 　　The molecular cloning,sequence analysis and high efficiency expression in E.coli of Chinese obese gene hou Wei,Miao Weimin,Zhou Bingrong,et al.Department of Microbiology,Second Military Medical University,Shanghai,200433 　　【Abstract】　Objective　To probe into the positional cloning of the Chinese obese gene, thereby providing an important approach to research of the mechanisms of obesity.Methods　The obese gene was amplified from the Chinese adipose tissue RNA by RT-PCR.Results　Sequencing analysis showed that the Chinese obese gene cDNA sequence was identical to that of Caucasian reported previously. The gene was cloned into a prokaryotic expression vector and high efficiency expression was realized in E.coli.Conclusion　This work is the basis for further researches on mechanisms of the obese gene product-leptin and its potential effect on treatment of obesity and diabetes mellitus, etc. 　　【Key words】　Obese gene　　Leptin　　Molecular cloning　　DNA (Chin J Endocrinol Metab, 1998,14：228-231) 　　随着人类生活水平的提高，肥胖已成为当今世界的一个常见问题。肥胖症是摄食和能耗平衡机制的失调，可引起多种疾病，如2型糖尿病、高血压、高血脂和癌症等。肥胖的人群每年花费300亿美元试图使自己变得苗条，那些无力减轻体重的人们将成为糖尿病和心血管疾病的高危人群。很早以前人们就开始对肥胖症进行研究，1783年Lavoisier和Laplace研究表明能量平衡受生理调节。1950年发现了第一个隐性基因突变，命名为肥胖基因(Obese gene)〔1〕，它是一个单基因突变，导致重度肥胖和2型糖尿病〔2〕，但其研究一直进展甚微。动物试验表明将肥胖鼠和正常鼠血液循环相连，肥胖鼠体重有所下降，提示正常鼠体内有一种因子可控制过度肥胖，而肥胖鼠则因基因突变而使该因子表达减少或作用丧失。经过8年努力，Friedman实验组运用定位克隆(Positional cloning)技术，分离得到小鼠的肥胖基因并得到人的同源序列〔3〕，为揭开肥胖症之迷及肥胖症的诊治奠定了基础。瘦素作用于下丘脑，控制代谢、能耗和生殖系统，调节体内脂肪含量。实验表明，重组的瘦素具有使肥胖小鼠代谢和体重正常化，恢复肥胖基因缺陷小鼠生育能力等活性，而无明显的副作用〔4，5〕。进一步研究发现，瘦素的受体基因正是以前报道的糖尿病基因(Diabetic gene)〔6，7〕，提示肥胖基因和糖尿病的关系密切。为了进一步研究瘦素作用机制及治疗肥胖症和糖尿病的可能性，我们运用RT-PCR的方法，成功完成中国人肥胖基因的克隆，序列分析，并在大肠杆菌中表达。 材料和方法 　　一、材料 　　1.脂肪组织：取自男性中国人胃切除手术病人的正常大网膜，液氮冻存备用。 　　2.试剂：RNA抽提液Trizol购自美国Gibco BRL公司，反转录试剂盒购自美国Promega公