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基因工程乙肝疫苗的制备 【摘要】基因工程乙肝疫苗是通过构建含有乙肝表面抗原的重组质粒转染酵母细胞，制备乙肝病毒表面的有效蛋白。本文主要介绍基因工程疫苗--重组酵母乙肝疫苗 （1）.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化学合成法直接合成目的基因或者通过鸟枪法克隆目的基因。用识别相同黏性末端的限制性内切酶将外源DNA和质粒分子切开。（切） （2）.用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上，构成DNA重组分子。（接） （3）.借组细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。（转） （4）.短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。（增） （5）.筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的基因工程菌。（检） 3.酵母表达的HBsAg之特性 重组酵母表达的HBsAg在没有化学处理的条件下自发地构成平均直径为22nm的球形颗粒。这些颗粒含有未糖基化的HBsAg多肽和主要由酵母特有的磷脂构成的脂基。其氨基酸的构成、羟基和氨基酸末端序列分析、质谱仪分析的肽谱等表明，重组酵母忠实地表达和生产了HBsAg。 酵母生产的HBsAg在细胞内以颗粒形式存在，其中的亚单位通过非共价键不紧密地结合在一起。在细胞外它转变成第二种形式，即单个多肽通过二硫键结合成二聚体，最后二聚体之间形成二硫键，得到二硫键交联的颗粒。它在表观上、化学性质和免疫性等方面都与血源HBsAg类似。 HBsAg比大部分生物分子要大，但比细胞要小，很适宜用膜分离方法纯化。 HBsAg表现出很强的疏水性，可用硫酸铵或聚乙二醇进行分步沉淀，或用疏水层析纯化。 HBsAg含有大量的二硫键，是其对热稳定的主要原因。在制备血源疫苗时，可运用长时间保温法以灭活HBV。但在制备重组HBsAg时没有必要。可选用更加温和的条件。 HBsAg对蛋白酶的抵抗力很强，可在pH为2的时候耐胰蛋白酶的处理。 HBsAg因其脂含量高，密度比一般蛋白低。利用其密度特性，可进行梯度离心分离。 4.疫苗的工作原理 任何疾病的疫苗都遵循以下免疫原理： （1）.将疫苗注射到人体内，疫苗通常含有已经死亡或者弱化的病毒。而乙肝疫苗就是一类没有感染能力的病毒蛋白，能引起机体的特异性反应。 （2）.免疫系统识别出体内的外来物质（病毒和细菌），这些外来物质也被称之为抗原。 （3）.一旦发现抗原，免疫系统就分泌出被称为抗体的蛋白质。这些蛋白质在血液中流动，将抗原杀死以消灭身体感染的病毒（或者与病毒蛋白质特异性结合，使之失去生物活性）。抗体是由淋巴细胞制造的。这些细胞也被称为B细胞，它的主要功能是产生能够特异性与抗原结合的抗体。 （4）.人体会储存这些抗体，淋巴细胞也会有记忆这种特殊抗原的功能。所以再次染病时，它们会及时消灭此种疾病的病毒，然而抗体的针对性很强，所以曾经接种过乙肝疫苗的人，面对其他疾病时仍旧会感染（值得注意的是：当人体感染真正的病毒时，抗体会不停繁殖，直到病毒最终被消灭。而疫苗会提供数量恰到好处的抗原，以帮助人体完成识别病毒和免疫反应的过程，从而使人体能够对这种病毒免疫）。 5.疫苗制备工艺 5.1.菌种制备和发酵 用成功构造的基因工程菌进行扩大培养，经过逐级放大至发酵罐。发酵过程应该具有下列特点：原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机和无机氮源；能容易进行大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产；生物反应过程是以生命体的自动调节方式进行的，多个反应像一个反应一样，在单一设备中进行；生产过程中，通常常温进行，操作温和，不考虑防爆问题；能够高度选择性的进行复杂化合物在特定部分的反应，如氧化、还原、官能团导入；生产过程中考虑防止杂菌的污染。 发酵过程中，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生长和维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡。可添加诱导剂如乳糖到发酵液中去以诱导可调节启动子的表达。 有人对重组酵母表达的HBsAg的影响进行过研究，发现在碳源中降低葡萄糖浓度，补充甘油和蔗糖能较明显地改善比活值和HBsAg的相对浓度。将发酵前期、中期和后期温度分别控制在27℃、33℃、25℃；发酵从pH4.5开始，逐步上升到pH6；以及维持溶氧浓度在最适水平（70%饱和度），都可以提高重组质粒的稳定性和HBsAg在发酵液中的积累。当然，需要根据不同菌种发酵的最适条件、培养基异同、当地条件等各种因素适当对以上数据进行微调，以保证发酵的顺利高效进行。 5.2.分离纯化和纯度测定工艺 虽然我们已经有从人血中分离纯化HBsAg的丰富经验，但由于重组酵母表达的抗原是在细胞内，存在的量相当小，仅占酵母蛋白、核酸和脂的5%不到，酵母细胞和培养基的成分与血浆有很大不同，为了从重组酵母中得到高纯度的抗原，有必要研究、探索新的纯化工艺。 对于血源性乙肝疫苗分离纯化的重点是除去活性污染物或使其失活，