昆虫杆状病毒表达系统简介及应用情况.docVIP

成 绩 南 京 农 业 大 学 硕 士研究生课程（论文）考试试卷 课程名称 病毒学 考试时间 2011.7.3 学号姓名 闵高仪 所在学院 生科院 任课教师 于汉寿 南京农业大学研究生院培养处印制 昆虫杆状病毒表达系统简介及应用情况 2010916006 闵高仪 摘要：昆虫杆状病毒表达系统作为四大表达系统之一 ,已广泛应用于重组蛋白的合成。该系统具有如多角体启动子控制下的高效表达，比较完善的转译后加工修饰，容易从无血清培养上清中纯化，无内毒素污染等特点。杆状病毒表达载体系统研究的最新进展：高强度早期启动子群杆状病毒转移载体的成功合成，以扩大寄主范围和增进重组蛋白稳定性为目的的亲本病毒的改造 通用的昆虫细胞培养基配方的不断优化，特定昆虫细胞株培养基的研制和适用于大规模悬浮培养的无血清培养基的商品化旨在进行复杂糖基化及提供相对稳定细胞环境的宿主细胞工程以新标记物载体和相关亲和层析方法为代表的蛋白质高效纯化方法的进步。昆虫杆状病毒表达载体系统在基础研究、医药卫生和农业上具有广阔的应用前景。 关键词：昆虫杆状病毒；表达系统；高效表达 体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工 、修饰。真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。1、杆状病毒的生物学特性 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。2、杆状病毒载体表达系统的特点 杆状病毒表达系统自从第一次用来表达干扰素以后在许多重组蛋白的表达中得到广泛应用，例如用于表达白介素(IL)一2，3、BMP及多种病毒蛋白等。相对其他表达系统它具有以下几个方面的特点：重组蛋白具有完整的生物学功能：杆状病毒表达系统可为高表达 的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。能进行翻译后的加工修饰：杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整的翻译后加工能力，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等，修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致：对比实验证明，在昆虫细胞发生的糖基化位点与哺乳动物细胞中完全一致，但修饰的寡糖种类却不完全一样。这种不一致对不同目的蛋白的活性影响不同，所以昆虫表达系统还可作为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面的理想模型。表达水平高：与其它真核表达系统相比较，此系统最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达，最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50％。能容纳大分子的插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大的基因片段，但目前尚不知杆状病毒所能容纳的外源基因长度的上限。能同时表达多个基因：杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时表达多个基因的能力。既可采用不同的重组病毒同时感染细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。 另外，昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能，能表达基因组DNA；还有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等。最后，杆状病毒对脊椎动物无感染性，现有研究也表明其启动子在N-％动物细胞中没有活性，因此在表达癌