文献检索综述RNAi在乳腺癌治疗中的应用.docVIP

现代分子生物学综述 RNA干扰在乳腺癌治疗研究的应用 （乳腺癌基因治疗进展） 摘要：RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指内源性或外源性双链RNA (double-stranded RNA，dsRNA)分子在基因转录水平上关闭相应序列基因转录所致的细胞内有效的、特异性的基因封闭。RNAi提出时间并不长，但这项技术已应用于多个领域，并取得了突飞猛进的发展。随着研究的不断深入，RNAi在基因功能研究尤其是肿瘤相关基因研究及肿瘤治疗中的应用方面将有着巨大应用价值。乳腺癌是是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤 关键字：RNA干扰，乳腺癌，基因治疗， 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，约占全身恶性肿瘤的7％～10％，其发病率逐年增高，严重威胁女性健康。人们对乳腺癌的认识也在不断的深入，从病理解剖学的认知到内分泌、分子生物学、肿瘤免疫学，乃至遗传、社会心理学多方面的认知，从发病和进展的角度来说，认为乳腺癌是一个全身性疾病是已被公认的事实。乳腺癌的常用治疗手段主要是以传统的手术治疗为主，术后辅以局部或全身的放射治疗、化疗及内分泌治疗。随着分子生物学技术及免疫学技术的迅猛发展，基因治疗逐渐成为肿瘤生物学治疗中的重要组成部分，1998年RNAi现象被发现，由于其能高效性、特异性等特点和优势，为基因功能的研究提供了强大的武器，也为乳腺癌基因治疗增添了新的活力。 RNAi概述 RNAi的作用机制 RNAi的机理包括起始阶段和效应阶段[1]。起始阶段：在RNAi的起始阶段，加入的dsRNA首先进入细胞，在其胞质中的RNase Ⅲ家族中一种特异识别dsRNA的RNA特异性核酸内切酶——Dicer酶，依赖ATP作用下被切割成19—23 核苷酸长度的具有双链结构的小干扰RNA small interfering RNAs，siRNAs)。效应阶段：siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC具有核酸酶的功能，与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，在结合部位切割mRNA，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，即放大效应，最终将靶mRNA完全降解。 RNAi的特性 （1）转录后水平沉默机制：RNAi是转录后水平的基因沉默机制；（2）特异性：RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；（3）高效性：RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；（4）可传播性：RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点;（5）ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Deicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。 RNAi的设计 常规的RNA干扰一般包括以下几个步骤：（1）目的基因选择：根据实验或治疗目的选取合适的目的基因。（2）siRNA设计与合成：根据目的基因mRNA，选取合适的siRNA系列并合成，目前常用的合成方法有化学合成、体外转录和用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA。（3）siRNA转染：目前常用方法有磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、脂质体载体介导、显微注射技术和DNA载体转染(病毒等)。各种方法适用于不同的细胞，但总的说来，效果都不甚理想。（4）RNA干扰效果检测：目标靶基因和无关对照的蛋白表达水平通过Western Noting或免疫荧光法检测，在严谨的条件下进行real-time RT.PCR分析，是一种检测siRNA效果的有效工具。对于癌细胞的检测一般用流式细胞仪检测其凋亡率。 乳腺癌RNAi常用的靶基因及研究现状 2.1 乳腺癌相关癌基因 原癌基因是人体细胞固有的基因，其表达产物在正常状态下为细胞增殖分化所必需，在特定条件下，原癌基因被激活诱导细胞恶性转化或恶变。抑制癌基因的功能可以达到治疗肿瘤的目的。与乳腺癌发生有关的癌基因主要有HER-2，ras，c-myc等。人表皮生长因子受体（HER-2）基因，目前已知