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2012物技术制药复习提纲 (第2章----第6章) 基本概念 质粒：是存在于细胞染色体之外的双链封闭环状的DNA分子。它含有有别于细胞染色体的独立复制子，能自主地复制自身的DNA。 高密度发酵：是一个相对的概念， 一般指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L。高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。 细胞工程 ：应用细胞生物学和分子生物学等学科的理论和技术，按照人们的需要，有计划、大规模地培养生物组织和细胞以获得生物及其产品，或者通过改变细胞的遗传组成以产生新的种或品种，为社会和人类生活提供需要。 单克隆抗体：是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。 多克隆抗体 ：由于病原微生物是含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体，即针对多种抗原决定簇的抗体。 人-鼠嵌合抗体：在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的重链（H）和轻链（L）可变区分离出来，分别与人Ig的重链和轻链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的人-鼠嵌合抗体。 改形抗体：用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig分子中的CDR序列，即可使人的Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合的特异性。可基本消除免疫原性。这种改形抗体又称CDR移植抗体。 Fab抗体用胃蛋白酶可将IgG的重链在铰链区的C端处裂解，获得两个完全相同的抗原结合片段（Fab）’端会有几对碱基缺失 置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺失 ③双链cDNA的克隆 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 ④目的cDNA文库的鉴定 局限性：①并非所有的mRNA分子都具有polyA结构； ②细菌或原核生物的mRNA半衰期很短； ③mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难； ④仅限于克隆蛋白质编码基因 目的基因获得的方法有哪些 鸟枪法：随机克隆目的基因的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的重组子，进而获得目的基因。适合于原核细胞的基因克隆分离。（工作量大；要有充分了解目的基因；不能获取最小的长度的目的基因；无法除去真核生物目的基因里的内含子） 反转录法：合成CDNA第二链两种方法，自身引导法和置换合成法。5’端有碱基对丢失 目的基因与载体相连：平头末端直接与载体相连，插入的片段无法回收。 平头两端分别接同聚物尾（AT同聚物尾）重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 反转录-聚合酶链反应。PCR与反转录法结合。MRNA经反应转录合成CDNA第一链，不需要再合成第二链而是在特异引物协助下，用PCR法进行扩增，特异性的合成目的CDNA链，用于重组克隆。 化学合成法：较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。前提是：必需已知目的基因的核苷酸序列或者 目的蛋白质的氨基酸顺序。 表达型载体的基本结构（P22） 大肠杆菌表达系统： 能独立复制：ori 有灵活的筛选标记和克隆位点 有强的启动子 有阻遏子，使启动子可控 有强的终止子 有mRNA翻译的起始信号：AUG，SD序列 PBV220系统和pET系统 酵母表达系统 影响目的基因高效表达的因素（分别以大肠杆菌和酵母为例） 大肠杆菌 1）外源基因的剂量：质粒的拷贝数增加，基因的表达产物增加 2）外源基因的表达效率：启动子的强弱；核糖体结合位点的有效性；SD序列和起始密码的间距；密码子的偏爱性 3）表达产物的稳定性：组建融合蛋白，引导外源蛋白分泌至周质间，改变真核蛋白质的二硫键位置，增加蛋白质的稳定性，采用蛋白酶缺陷型菌株。 1.外源基因的剂量：质粒的拷贝数和稳定性 2.外源基因表达的效率 启动子：组成型启动子和诱导型启动子 分泌信号：信号肽和前导肽，帮助产物分泌至细胞，并在适当的部位由胞内蛋白酶加其切断，产生正确的产物分子。 终止序列的影响：(1) 保证转录产物在适当部位终止和加上PolyA尾部，这样形成的mRNA稳定并能被有效的翻译。(2) 在酵母表达中的人工合成基因一般没有终止序列，须借用外加的终止序列或载体上现有的终止序列(3) 常用的有：ADH1，CYC1，MFα1和PGK(1) N-糖苷键(天冬酰胺连接)和O-糖苷键 (2) 酵母能正确识别外源蛋白的糖基化信号，因而蛋白可分泌至胞外 (3) 分泌的异源蛋白糖基化产物与天然产物相同，可用于生产医用蛋白质 (4