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第五章 酶分子修饰 ;; 与底物相结合，使底物与酶的一定构象形成复合物 ;徊耳顾框倔雪彤骗净挡撕溉杠肠慑毕屎煽膀皆劳牧迂瑰蔓壶影泞宙挖揪馆第5章酶分子的修饰第5章酶分子的修饰;一、酶分子修饰的目的;一、酶分子修饰的目的;二、选择酶分子修饰剂 特性：;三、选择反应条件;酶的化学修饰;酶的化学修饰;第一节 金属离子置换修饰;二、作用范围 含有金属离子的酶 金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的活性起重要作用。 （ 1 ）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入原离子则酶复活。 （ 2 ）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可使酶呈现不同特性。;三、金属离子置换修饰的过程 ;三、金属离子置换修饰酶的作用 ;三、金属离子置换修饰酶的作用 ;第二节 大分子结合修饰;二. 修饰剂： 要求：具有较大的分子量、良好的生物相容性和水溶性。这样，经修饰的酶，其半衰期较长，活力回收较高。 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。;(1)PEG分子量为1000一10000的修饰效果较好，用甲氧基PEG效果更好。; 三、修饰：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。;（1）三氯均嗪法 PEG经三氯均嗪活化后，用石油醚抽提或减压蒸馏，制得活化PEG，后者与酶交联，制得修饰酶：;（2）琥珀酸酐法 常用二溴代琥珀酸酐在温和的碱性条件下将PEG活化，经减压浓缩制得活化PEG，活化PEG与酶分子上氨基发生交联反应，而得修饰酶：;（3） 重氮法 是将PEG末端羟基转化为重氮基团，再在弱碱性条件下与酶分子的酚基、咪唑基等反应，而生成修饰酶。 主要反应有以下三种。 ①对—硝基苄基氯活化法。;②N—羧甲氨基苯甲酐活化法;③4—氟—2—硝基重氮物活化法;2、修饰： 活化后的大分子修饰剂与经分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应，使两者以共价键结合。 3、分离： 通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。; 右旋糖苷————（高碘酸HIO4）活化右旋糖苷;四、大分子结合修饰的作用 ;2、增强酶的稳定性 ;3、改变酶的抗原性 ; a. 抗原：能引起体内产生抗体的物质 b. 抗体：当外源蛋白非经口进入人或动物体内后，体内血清就可能出现与此外源蛋白特异结合的物质 酶对人体是一种外源蛋白，当经注射进入人体后会成为抗原，刺激体内产生抗体。当这种酶再次进入体内，抗体就会与作为抗原的酶特异结合，而使酶失去催化能力。 ;抗体与抗原间特异结合是由于它们之间特定分子结构引起的。用酶分子修饰法使酶的结构产生改变，抗体、抗原就不再特异结合，可能降低或消除其抗原性。 利用水溶性大分子对酶进行修饰可降低或消除酶的抗原性。;第三节 酶蛋白侧链基团修饰;侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。 20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。;2.带负电荷的极性R基氨基酸（共2种）： 天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D), 谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E); 4. 非极性R基氨基酸（共8种）： 丙氨酸(Alanine,Ala,A), 亮氨酸(Leucine,Leu, L), 缬氨酸(Valine,Val,V)), 异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M), 脯氨酸(Proline,Pro,P); 这些基团可以组成各种副键，对酶的空间结构的形成和稳定起着重要作用。如果这些基团发生改变，就会引起副键的改变，使空间结构发生改变，从而引起酶的特性和功能的改变。;;一、氨基修饰;①乙酸酐修饰 ;③2，4—二硝基氟苯修饰(Sanger反应);⑤丹磺酰氯(DNS)修饰。; 二、羧基的化学修饰 修饰羧基的反应专一性较差。 常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子中羧基的数目。 + ? 水溶性碳化二亚胺 ;三、巯基的化学修饰 来源：Cys 修饰反应:烷基化 修饰剂：碘乙酸(IAA) 碘乙