光合细菌的分离，筛选和培养.doc

光合细菌分离筛选与培养 着色菌属或称红硫菌属的分离与纯化培养，着色细菌与绿菌属一样也是光合细菌，但它们除了含有叶绿素外，还含有胡罗卜素，而且后者占优势。其细胞除球形外．有柱状，偶有弯曲有荚膜及极生鞭毛，能运动，细胞团块呈深浅不一的红色或紫红色。在有硫化氢条件下生长时，能氧化硫化氢与硫，累积硫于细胞内，而绿色硫细菌却沉硫于细胞外。分布在有腐烂藻类植物的海泥和淡水泥中。 1 分离培养基成分及其配制，由于此种完全培养基的有些成分不能在高压灭菌．或在高温下不相容必须先制备好基础培养基，然后把其他成分的无菌溶液加到冷基础培养基中。（1）基础培养基：NH4Cl 0.1 克 KH2PO4 0.1 克 MgCl2 0.05克 NaCl海生种30 克 淡水种10克 琼脂 20克 水 925毫升，溶解以上无机盐于水中，加入琼脂，加热至121℃ 15分钟，使琼脂溶解，分装于试管或螺旋口瓶里．121 ℃ 蒸汽下灭菌15分钟。不加琼脂可作为液体培养基。（2）无菌碳酸氛钠溶液：将NaHCO3 5克加水至100 毫升，在121℃ 蒸汽下灭菌15 分钟。（3）无菌硫化钠溶液：此液既作为HS-的来源，又起脱氧剂作用，若是预先配制，必须把它保存在没有氧的密闭容器里，否则应在临用前配制。取Na2S·9H2O 5克加水至100 毫升，在121 ℃ 蒸汽下灭菌15分钟．（4）完全培养基：基础培养基（融化冷至45 ℃ ） 10毫升 NaHCO3溶液 0.4毫升 Na2S9H2O 0.2毫升，依次无菌地如到基础培养基中，混匀后可用。 2.分离与纯化培养（1）分离培养：在广口玻璃瓶底放一层0.5-1厘米厚的混有腐烂海藻的海泥，用海水覆盖，暴露于光下。直至培养器最靠近光源的壁上长出红色菌为止。这些红色生长物通常含有着色菌．它的生长决定于泥中硫酸盐的还原，和随后释放的H2S。（2）纯化培养① 深层试管法：a 、选取具有着色菌特征的红色生长物（已用显微镜检查过细胞形态），放于一定量的完全培养液中，混匀。b ．准备一系列深层融化的完全培养基管，并保存在45 ℃ 水溶中，将混匀于培养液中的生长物稀释成一系列稀释度。c ．每支试管用经160 ℃ 灭菌1 小时的固体石蜡和液体石蜡1:1 的混合物覆盖，每管盖2 厘米高。d 曝光于25-28 ℃ 下培养，3-7 天后完全分开的红色菌落出现在较高的稀释度里。选择一支合适的试管培养物表面灭菌，切断玻璃，移去管子，然后在无菌的培养皿里，以无菌操作法把菌落解剖出来。e. 在无菌的完全培养基里乳化菌落，并在一系列稀释度中重复以上操作培养，保证纯度。纯培养物可在这些深层琼脂里保存，2 个月移种一次。② 琼脂培养基划线法：将红色生长物在完全培养基平板上划线接种，于厌氧条件下曝光25-28℃，培养4-7天．挑出典型菌落，重新划线培养，直到纯化为止。纯化后可保存在深层完全培养基中． 红螺菌属的富集培养与分离：其中包括红色红螺菌（ 或称深红红螺菌）、度光红螺菌、巨大红螺菌、长形红螺菌、纤细红螺菌（或称细小红螺菌）、棕黄色红螺菌（或称黄褐红螺菌），此类细菌均生长于水和淤泥中，属厌氧或微嗜氧菌，在厌氧条件下．于光亮中能合成有机物．细胞螺旋状盘绕，长度不一，有不等数蜷曲．同种细胞的大小变化很大，有端生丛毛，能运动。细胞内含有菌紫素。菌绿素和类胡罗卜素等．故细菌呈红色、褐红色、绛红色或玫瑰色不一。1．富集培养（1）培养基成分及配制：NH4Cl 1.0 克 K2HPO4 0.5 克 MgCl2 0.2克 NaCl 0.1 克 酵母膏 0.1克 H2O 900毫升，将上面各物溶解于水，在121℃ 蒸汽下灭菌20 分钟。分别制备及过滤除菌下列各液：①5克碳酸氢钠加50 毫升蒸馏水溶解。② 乙醇或4%丙氨酸．③0.1N的磷酸溶液。在基础培养基中加入碳酸氢钠溶液和1.5-2.0毫升乙醇或50毫升4%丙氨酸．用0.1N的磷酸调pH 至7.0（2）富集培养：① 最适的接种物是暴露在光下的富含有机物的淤泥。接种时，放淤泥于50 毫升的带玻璃塞的磨口瓶中．酌量放一层。② 加满培养基，塞好塞于， 隔绝空气。③ 置于30 ℃ 的照明箱中培养，培养物放在离照明的25 瓦钨丝灯4 英寸处。④ 观察 通常在3 天内可见到液体培养基里和淤泥曝光的一侧呈现微红色的生长物。⑤ 从微红色处取1 毫升的富集培养物，接种于第二瓶的富集培养基中，培养2 天．2．分离培养（1）培养基成分及配制：从上面的富集培养基中加酵母膏至0.2%，及1.5-2.0克琼脂（但碳酸氢钠应改为2 克），制法同上。另取Na2S·9H2O 1 克，加水10 毫升，于121 ℃ 蒸汽下灭菌15分钟，在调pH 之前将此液加到分离培养基中，分装，灭菌后制成平板或柱状培养基。（2）接种：取富集培养物于分离平板培养基上划线或涂