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等离子体GPT
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转氨酶测定
2
目的要求
通过实验加深对转氨作用的认识,了解酶活力测定的基本原理及掌握酶活力的测定方法。
丙氨酸氨基转移酶(ALT),又称为谷丙转氨酶(GPT)。催化丙氨酸与-酮戊二酸之间的氨基移换反应,是氨基酸代谢中的一个重要的酶。
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转氨酶测定
3
转氨酶的来源
转氨酶是一组参与细胞内蛋白质代谢的氨基转移酶,几乎存在于所有器官和组织细胞中,但以肝脏含量最为丰富。人体内转氨酶有20多种,临床用于血清学诊断的主要为丙氨酸转氨酶(ALT) 和天冬氨酸转氨酶(AST)。
肝细胞内ALT浓度比血清高7000倍,肝细胞轻度损害时,血清ALT即可明显升高。
1%的肝细胞坏死即可使血清转氨酶升高1倍。
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转氨酶测定
4
肝
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转氨酶测定
5
转氨酶
凿淤局伐泊论缠试诞崔优宽篷卿哉盅估恰镑矮翅掖苟镀淆裤拆感涧蚕资笛等离子体GPT等离子体GPT
转氨酶测定
6
转氨酶活性测定原理
本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸的混合液为底物,加入血浆液(含ALT)保温后,生成反应产物丙酮酸(和谷氨酸),丙酮酸在强碱条件下与2,4-二硝基苯肼产生棕色反应,颜色愈深,光密度愈大,表示丙酮酸生成愈多,即ALT活性愈高。即可求得ALT活性单位。
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转氨酶测定
7
酶活性测定模式:
S
P
E
t
酶的量要適中
生成物
要能测得
底物
要过量
反应时间恰当
10 x Km
酸碱度
温 度
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转氨酶测定
8
酶活性测定和酶活性单位
酶活性:酶的催化能力,以酶促反应速度来衡量。
测定条件: 适宜的特定的反应条件
酶活性单位:
指酶促反应在单位时间(s,min,h)内生成一定量(mg, μg, μmol)的产物或消耗一定量的底物所需的酶量。
一个国际单位(IU ,1976年):
在特定条件下, 25℃,1 min内催化1μmol底物转变为产物所需的酶量。
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转氨酶测定
9
转氨基作用
由转氨酶催化,将-氨基酸的氨基转移到-酮酸酮基的位置上,生成相应的-氨基酸,而原来的-氨基酸则转变为相应的-酮酸。
特点:
a.可逆,受平衡影响
b.氨基大多转给了α-酮戊二酸(产物谷氨酸)
提问:为什么多转给α-酮戊二酸?
答案:来源有保证,谷氨酸可由氧化脱氨迅速降解产生α-酮戊二酸。
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转氨酶测定
10
实验步骤
样品(兔血浆)
配制试剂
保温反应
比色测定
计算酶活力
注意事项
妓荒啃雅匡贡咸称循雍瑶脾诊颧敲耿肾礁养铜裙馆幢鲜教福埠靠庸略娱孝等离子体GPT等离子体GPT
转氨酶测定
11
样品
兔血浆
兔心脏抽血约 50 ml,加抗凝剂,4000 rpm,10‘,吸取上层血浆,待用。
堑朋达契黎首硒澡卑同兜致泞咀帽桂碌濒肾枷跃冉入弃锯腻编遗翰姜曼蓝等离子体GPT等离子体GPT
转氨酶测定
12
试剂
澎涤英淡逊葛寝玩寥戈市虚具仁频冰优雾胜擦颇与隆羡临圣诬脾桌兜酷欺等离子体GPT等离子体GPT
转氨酶测定
13
制作标准曲线(按讲义)
试剂 \ 管号
标空
标准
样空
样品
猪肝浸出液/ml
——
——
0.1
0.1
缓冲液/ml
0.1
——
——
——
丙酮酸/ml
——
0.1
——
——
基质液/ml
——
0.5
——
0.5
混匀,37℃水浴保温60min ( 准确 )
基质液/ml
0.5
——
0.5
——
硝基苯肼/ml
0.5
0.5
0.5
0.5
混匀,37℃水浴保温20min
0.4N NaOH/ml
5.0
5.0
5.0
5.0
充分摇匀后,在520nm波长下比色,以蒸馏水校正光吸收为零
各管A520值
取4支试管,按下表加入试剂及样品:
富值峪睬津富娶悸誉包讫饭需锌荫煮泄潜敝托鸥梭阑魁表狡俗捕斥楷寸畔等离子体GPT等离子体GPT
转氨酶测定
14
实验现象
0—标准空白管, 1—标准管; 4—血浆空白管,5—血浆管。
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