NHXXXX_XXXX原核转录组生物信息分析结题报告.PDFVIP

NHXXXX_XXXX原原核核转转录录组组生生物物信信息息分分析析结结题题报报告告 建库测序流程 Total RNA样品检测 文库构建 库检 上机测序 生物信息分析流程 结果展示 说明 原始序列数据 测序数据质量评估 参考序列比对分析 基因表达水平分析 RNA-seq整体质量评估 基因差异表达分析 差异基因GO富集分析 差异基因KEGG富集分析 SNP和InDel分析 新转录本预测 基因结构分析 UTR分析 反义转录本预测 sRNA分析 参考文献 附录 文件 目录列表 软件列表 Methods英文版 备注 1 / 52 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 一一、、建建库库测测序序流流程程 从RNA样品到最终数据获得 ，样品检测、建库、测序每一个环节都会对数据质量和数量产生影响 ，而数据质量又会直接影响后续信息分析的结果。为了从源头上 保证测序数据的准确性 、可靠性 ，诺禾致源对样品检测、建库、测序每一个生产步骤都严格把控 ，从根本上确保高质量数据的产出。流程图如下 ： 2 / 52 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 1 Total RNA样样品品检检测测 诺禾致源对RNA样品的检测主要包括4种方法 ： (1) 琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以 是否有污染 (2) Nanodrop检测RNA 的纯度 （OD260/280比值 ） (3) Qubit对RNA浓度进行精确定量 (4) Agilent 2 100精确检测RNA 的完整性 2 文文库库构构建建 样品检测合格后 ，用带有Oligo （dT ）的磁珠富集真核生物 RNA （若为原核生物 ，则通过试剂盒去除rRNA来富集 RNA ）。随后加入frag entation buffer将 RNA打断成短片段 ，以 RNA为模板 ，用六碱基随机引物 （rando hexa ers ）合成一链cDNA ，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA poly erase I合成二链cDNA ，随后 利用AMPure XP beads纯化双链cDNA 。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头 ，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择 ，最后进行PCR富集得 到最终的cDNA文库。构建原理图如下 ： 3 库库检检 文库构建完成后 ，先使用Qubit2.0进行初步定量 ，稀释文库至1ng/ul ，随后使用Agilent 2 100对文库的insert size进行检测 ，insert size符合预期后 ，使用Q-PCR方法对 文库的有效浓度进行准确定量 （文库有效浓度 ＞2nM ） ，以保证文库质量。 4 上上机机测测序序 库检合格后 ，把不同文库按照有效浓度 目标下机数据量的需求pooling后进行HiSeq/MiSeq测序。 3 / 52 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 二二、、生生物物信信息息分分析析流流程程 获得原始测序序列(Sequenced Reads)后 ，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下 ，通过如下流程