RNA干扰技术阻断黏着斑激酶表达对肝星状细胞增殖及凋亡影响.pdf

中文摘要 RNA干扰技术阻断黏着斑激酶表达对肝星状细胞 增殖与凋亡的影响 摘 要 肝纤维化(hepatic 肝病，进而发展为肝硬化的共有病理改变和必经途径。肝星 stellate 状细胞(hepatic 胶原等细胞外间质(extracellular 形成的中心环节。因此，抑制HSCs活化、增殖并诱导其凋 亡是逆转肝纤维化的关键所在。 adhesion 黏着斑激酶(focal 导通路中连接整合素与下游信号分子的媒介，处于细胞内多 条信号转导通路的交汇点，能激活多条信号转导通路。FAK 被激活后可以调节其下游信号分子，引起细胞骨架重组和多 种基因表达，如可以通过Ras依赖的丝裂源活化蛋白激酶 ActivatedProtein (Mitogen 应，参与细胞铺展、增殖、分化与凋亡等多种生物学行为。 多项研究表明FAK在成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞及 多种肿瘤细胞的增殖、凋亡中发挥关键作用，但对HSCs增 interference， 殖与凋亡的影响知之尚少。RNA干扰(RNA RNAi)是目前最有效的基因沉默技术，能特异性抑制靶基因 的转录，进而下调相应蛋白水平及功能。 为此，我们采用RNAi技术，以FAK为切入点，在前期 应用含U6启动子及增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreen fluorescent 中文摘要 聚合物介导下将干扰质粒瞬时转染HSCs，研究特异性阻断 与凋亡的影响及其机制。 目的：采用RNAi技术，探讨FAKshRNA对HSCs增殖、 增殖与凋亡中的作用。 离子聚合物梭华．sofastTM介导下，应用FAK shRNA质粒转染 大鼠肝星状细胞系HSC．T6。实验分5组：①空白对照组(简 写为sofast组)；(至)pEGFP．HK pEGFP．FAKshRNA组(简写为FAKshRNA组)；②～⑤组中 FN浓度均为10 lag·mL～。 采用MTT法测定HSCs增殖；流式细胞术(flow cytometry， FCM)、末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口 末段标-}E(terminal dUTP deoxynucleotidyl end nick blot及real．time 亡；采用Westem Q．PCR等实验方法，检测 Western 情况。 结果：①FAKshRNA抑制FAK mRNA表达较Con组升高 Q．PCR结果显示转染后FN组FAK FAK shRNA组FAK mRNA表达水平较HK组显著下降， P0．01，且最高下调率为76．73％，出现在转染后24 h；②FAK 中文摘要 shRNA抑制FAK表达及活化：Westernblot结果显示，FN刺 激后HSCs shRNA 但与sofast组、HK组比较无明显差异，P0．05；FAK 率为72．53％，出现在转染后48 表现出相似的变化：FAK 组显著下降，P0．01，且最高下调率出现在转染后48h，与