PCR技术及其应用-生物探索.ppt

DNA条形码技术(DNA barcoding)是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段(DNA barcode)自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统,它可以对物种进行快速的自动鉴定。 DNA Barcoding的概念由加拿大动物学家Paul Hebert首次提出。 Paul Hebert等对动物界包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13 320个物种的线粒体细胞色素c氧化酶亚基1（Cytochrome coxdase I，CO I）基因序列比较分析，除腔肠动物Cnidaria外，98%的物种遗传距离差异在种内0%-2%，种间平均可达到11.3%，据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种；他们将超市用以区分成千上万种不同商品的条形码概念引入，把这种小片段基因序列称作物种的DNA条形码（DNA barcodes）并提出为全球生物编码的计划。 DNA条形码的原理 DNA是生物的遗传信息载体。遗传基础的不同，决定了生物的多样性。由于每种生物物种的DNA序列都是唯一的，就给DNA条形码提供了物质基础，每个位点上都有A、T、G、C 4种选择。 由于部分碱基的保守性，几十个碱基的长度不能提供足够的编码信息，因此目前的DNA条形码分析都是基于几百个碱基长度的DNA序列。 DNA条形码的标准 Kress等(2005)和Taberlet等(2007)提出了理想的DNA条形码标准： (1)具有可以区分物种的足够变异和分化，同时种内变异必须足够小； (2)有高度保守的引物设计区以便于设计通用引物； (3)片段足够短，以便于DNA提取和PCR扩增，尤其是对部分降解的DNA的扩增。 DNA条形码的优点 生命条形码联盟(consortium for the barcode oflife, CBOL)阐述了DNA条形码的优点： (1)以DNA序列为检测对象，其在个体发育过程中不会改变。同种生物不同生长时期的DNA序列信息是相同的，即使经过加工，形态发生变化，而DNA序列信息不会改变，较之传统的方法，扩大了检测样本范围；同时样本部分受损也不会影响识别结果。 (2)可进行非专家物种鉴定。该技术是可机械重复的，只要设计一套简单的实验方案，经过简单培训的技术员即可操作。 DNA条形码的优点 (3)准确性高。特定的物种具有特定的DNA序列信息，而形态学鉴别特征会因趋同和变异导致物种的鉴定误差 (4)通过建立DNA条形码数据库，可一次性快速鉴定大量样本。分类学家新的研究成果将不断地加入数据库，成为永久性资料，从而推动分类学科更加快速深入地发展。 操作及分析方法 1.提取目的基因 2.PCR 3.电泳 4.结果分析 植物DNA的提取 1.2g新鲜植物叶片，液氮中研磨尽量越细越好； 2.至50ml离心管中，加8ml细胞提取液，混匀，65℃水浴保温20min； 3.取出离心管，加入2.5ml 5mol/L KCl溶液，混匀，冰浴20min； 4.4000r/min×20min，并转移上清至另一50ml离心管； 5.加等体积酚/氯仿混匀，12000r/min×5min，取上清； 6.加等体积氯仿，混匀，12000r/min×5min，取上清； 7.加入0.6-1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀 8.离心获得沉淀，70%乙醇洗3次。干燥沉淀（不要太干，否则DNA不易溶解）。 9.加入200μL TE缓冲液，溶解DNA； 10.上清液就是所需的目的基因DNA。 参考：《分子生物学实验指导》（第二版） 高等教育出版社 主编：魏群 聚合酶链式反应（PCR） 1.PCR技术的创建 2.PCR的原理 3.PCR的反应体系和方法 4.PCR技术的近现代运用 三篇重要论文 经典循环参数（500bp以内） 琼脂糖凝胶电泳 1.操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理； 2.凝胶结构均匀，含水量大，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附微笑，因此图谱清晰，分辨率高，重复性好； 3.琼脂糖凝胶无紫外吸收，所以电泳过程和结果可以直接用紫外检测和定量分析； 4.电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测量，制成干膜可以长期保存。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 1.在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 2.化学性能稳定，与被分离物不起化学反应； 3.对PH值和温度变化稳定； 4.几乎无电渗作用，只要Acr（丙烯酰胺）纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； 5.凝胶孔径可调节，跑胶过程更加自由； 6.样品不已扩散，且用量少； 7.比琼脂糖凝胶电泳拥有更高的分辨率 DNA条形码在植物中的研究现状 为了寻求一种通用的植物条形许多学者进行了积极的探索，已出了多种条形码片段或组合方但至今仍没