第七章 外源基因表达系统课件.ppt

第七章  外源基因表达系统; 基因工程所用的宿主菌,都是经过人工改造的. 原因是 野生型细菌具有针对外源DNA的限制和修饰系统,会切割未经修饰的外源DNA. 经过改造的宿主菌一般具备下列特点 限制系统缺陷型:不切割外源DNA. 重组缺陷型 :避免外源DNA与宿主DNA的重组. 转化亲和型:改变细胞壁的通透性,提高转化效率. ;第一节 大肠杆菌表达系统 一.大肠杆菌表达体系的优点： 外源基因可以高水平表达 培养方便、价廉、可大规模生产 生物学、遗传学背景清楚 安全性好 寄主菌株及载体较多 ;大肠杆菌;二.大肠杆菌的表达条件;启动子有关知识;常用的大肠杆菌启动子;启动子的可控性;当重组大肠杆菌生长到某一阶段，向培养物中加入乳糖或IPTG（异丙基硫代半乳糖苷 isopropylthiogalactoside，IPTG),它们特异性的与阻遏蛋白结合，使之从操纵子上脱落下来，启动子打开并启动外源基因转录。（化学诱导）;温度诱导; 化学诱导与温度诱导在实验室规模比较容易做到，（发酵罐1～5升）。但在工业化生产时（发酵罐数十升～数百升乃至数千升），生产成本很高。; 为解决此问题，可对工程菌进行改造。 　例如：采用双质粒表达系统　将CI 857阻遏蛋白编码基因置于Ptrp启动子之下，克隆在一个低表达质粒上，从而保证阻遏蛋白表达较低；第二个重组质粒则含有PL启动子控制的目的基因。当培养基中缺少色氨酸时， Ptrp打开， CI 857 阻遏蛋白生成，由PL介导的目的基因不表达；相反，当色氨酸大量存在时， Ptrp启动子关闭， CI 阻遏蛋白不再生成， PL开放。; 此工程菌可用糖蜜和酪蛋白水解物组成的廉价培养基进行发酵，内含微量的色氨酸，欲使外源基因表达时，可加入富含色氨酸的胰蛋白胨进行诱导。;原核表达存在的问题 翻译后的加工修饰 真核细胞的某些蛋白质翻译合成后，还需要修饰，如糖基化，但大肠杆菌细胞无此功能。 细菌蛋白酶的存在 细菌蛋白酶对外源蛋白质的切割;真核基因在大肠杆菌细胞中的表达;优点： 形成包涵体，易于纯化分离，抵抗细菌蛋白酶的水解；对寄主无毒害 蛋白质产量高 表达载体构建比较简单 ;缺点： 形成包涵体的外源蛋白质，一般没有生物活性。恢复生物学活性的过程，有时非常困难。活性蛋白质的终产量低。 细胞质还原的环境不利于形成二硫键 N-末端存在甲硫氨酸，蛋白质真实性受影响 蛋白质种类多，纯化工作量比较大。;②周质中表达 周质（periplasm)—大肠杆菌一类格兰氏阴性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构 表达于细胞质中的蛋白，借助信号肽穿过细胞内膜到达周质;优点： 蛋白种类少，易纯化 酶解程度低 促进二硫键的形成和蛋白质的折叠 蛋白质N-端真实性 缺点： 转运的效率不稳定;③ 表达产物分泌到细胞外 诱导大肠杆菌细胞分泌外源蛋白质 利用信号肽； 融合蛋白配体； 透化剂；;优点： 酶解作用低 纯化方便 增进蛋白折叠 N-端的结构真实;分泌表达形式的缺点： 相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因即便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多。 ;短小芽孢杆菌表达蛋白质;利用梭菌属嗜热菌株由纤维素生产乙醇;第二节 酵母菌表达体系;酵母菌的种类;一.啤酒酵母;啤酒酵母特点;二.甲醇酵母表达体系;1.甲醇酵母的生物学特点 ;2.甲醇酵母表达系统的优点;表达量高，数百mg/L以上水平 表达的蛋白既可存在于细胞，又可分泌到胞外。由于甲醇酵母自身分泌的蛋白（背景蛋白）非常少，十分有利于纯化。 糖基化程度低。;多型汉逊酵母表达系统;3.应用举例;应用举例;第三节 昆虫细胞表达系统;　　昆虫表达系统 ;家蚕表达系统; 我国科学家于2003年率先完成家蚕基因组框架图，覆盖率和精确度分别达到95.54和99.95，是我国科学家向人类社会贡献的第三大基因组研究成果。 ;家蚕的特点是丝素蛋白的高效表达。蚕丝的主要成分是丝素蛋白。在家蚕的丝素蛋白合成期，每个细胞每秒合成数万个丝素分子。;杆状病毒载体;杆状病毒载体的构建;二.昆虫细胞宿主;第四节 哺乳类细胞表达系统;常用的哺乳动物表达细胞;COS细胞 来源于非洲绿猴肾细胞系（CV－1），属于瞬时表达细胞。即由于转染质粒在宿主细胞中大量表达，导致细胞死亡。 ;从2000年以后，哺乳动物细胞表达系统更受重视。目前，美国418种在研药物中约70%是以哺乳动物细胞表达的。在FDA已批准上市的生物技术药物中，哺乳动物细胞表达的产品占70%以上。;一.用于哺乳动物细胞表达的载体;1.SV40病毒载体;重组的病毒-质