含PH结构域蛋白CKIP-1的亚细胞定位机制探究.pdf

北京协和医学院硕士研究生论文 论文题目金￡塾结掏堡蛋自堡K!￡二!的垩绁照定僮扭剑婴究 申请人姓名 墨遗立 导 师 贺福初院士 导师组成员 韭佥强副受塞旦 学科专业 遗传学 入学时间 2005年9月 所在单位 j匕塞坯独医堂院基趟堂院 二零零八年五月 北京协和医学院硕士研究生论文 目 录 目 录………………………………………………………………………··1 中文摘要………………………………………………………2 ．……………………………．…………………………………………3 Abstract 英文缩写词………………………………………………………．4 主要仪器设备和常用试剂的配制…………………………………5 前 言 ………………………………………………………………………．7 第一章CKIP．1入核转运依赖核定位信号………………………一11 第一节CKIP一1的PH结构域单独表达时定位于细胞核………．12 第二节PH结构域内含有非经典核定位信号…………………．18 第三节CKIP一1转运入核需要依赖核定位信号………………一25 ……………．29 第二章CKIP．1存在自抑制机制从而调控其定位 第一节CKIP一1分子存在自身抑制作用………………………．29 构建及重组蛋白的表达和纯化…………………………．．39 总结与展望………………………………………………………．46 参考文献……………………………………………………一51 附录1：引物序列、名称、用途……………………………………一56 附录2：综述………………………………………………………60 在读期间发表和投稿的文章………………………………………66 致 谢………………………………………………………………………．67 北京协和医学院硕士研究生论文 中文摘要 蛋白适当的亚细胞定位是其发挥相应功能的前提，蛋白定位发生异常，将会 kinase2 对细胞功能甚至生命产生影响。酪蛋白激酶．2相互作用蛋白．1(casein interactingprotein．1．CKIP．1)是一个含PH结构域的质膜定位蛋白。基于细胞、 分子水平的研究表明，CKIP．1参与调控肌细胞分化、细胞骨架重组、细胞凋亡、 肿瘤细胞生长，以及募集核内的CK2和ATM激酶到质膜等。本实验室最近建立 了CKIP．1基因敲除小鼠模型，首次从遗传学角度发现其生理功能是一个新的骨 形成负调控分子，机制是CKIP．1结合并增强特异调控成骨细胞活性的泛素连接 酶Smurfl的活性。CKIP．1发挥上述功能主要依赖于其质膜定位，但其质膜定位 机制依然不清楚，也是本论文回答的主要问题。此前的研究认为，其PH结构域 通过与质膜磷脂结合，决定了CKIP．1的质膜定位。但我们的研究吃惊的发现， CK／P．1的PH结构域单独过表达，却完全定位于细胞核。不同标签的PH、不同 细胞系中均得到同样的结论。这提示CKIP．1的亚细胞定位机制比先前认为的要 复杂。进而，我们鉴定了CKIP．1的PH结构域内的一个强的非经典核定位信号 NLS功能所必需。通过系列缺失突变分析，我们发现CKIP．1的C末端序列(aa 361—382)可通过与N端PH结构域的相互作用抑制PH的核定位功能，这种自抑 (aa 338．409)可以募集CKIP．1显著入核，而且存在剂量效应关系，其机制是打破 研究提出了一种新的CKIP．1质膜定位决定机制：CKIP．1亚细胞定位是通过N 端PH结构域内的NLS和N端．C端自抑制作用共同决定的，CKIP．1入核需要 NLS介导，但通常情况下NLS受C端的抑制，同时P