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遗传 HEREDITAS(Beijing) 3(6)- 13-161981 介绍一个半微量单向混合白细胞培养方法 周光炎 陆佩华 富赛里 减人杰 （上海免疫学研究所） 人类混合白细胞的反应，主要受控于组织 克／毫升，过滤除菌后保存于一20℃冰箱。用前 相容性复合体 HLA中的D区基因3j〔oD区基 加缓冲剂 HEPES25mM，并以NaHC03调节 因产物在器官移植中起重要作用，并直接参与 pH至7。用于细胞培养的 RPMI1640，需另 T淋巴细胞的激活和免疫调节61〔。运用同位素 加20多混合人血清 （取自20名以上正常男性 掺人技术作混合白细胞培养 M（LC）比培养后 或无妊娠史女性外周血分离而得）-20℃保 作形态计数，能更有效地以淋巴细胞的增殖强 存，用前56℃灭活30分钟。 度来判别这些基因产物的个体差异。目前国外 二（）丝裂．紊处理 悬浮于不含血清 所采用的微量技术需要配备半自动细胞收集器 培养液中的PBMC浓（度 1X106／毫升），以最终 及其它微量设备(4［1，国内一时还难以普遍运用。 浓度40微克／毫升的丝裂霉素C（日本Kyowa 为此我们采用国产塑料小管，以常规技术发展 产品）37℃处理30分钟，使之丧失增殖能力而 了一个相应的半微量单向混合 白细胞培养方 仅提供同种异体抗原。细胞经 Hanks，液洗三 法，发现利用最适条件并作倾斜培养使细胞充 次后再悬浮于含20务血清的培养液，计数并记 分接触，能够提高实验系统的分辨力，从而有可 录活率锥（蓝染色活细胞通常在98关以上）。 能缩短培养时间，以利尽快检测出不同遗传背 （三）单向混合白细胞培养 在严格无 景个体间反应性的差异。 菌操作下取0.25毫升反应细胞 浓（度为每毫升 0.5X106）和0.25毫升经丝裂霉素处理的刺激 材 料 和 方 法 细胞浓（度为每毫升1X106)，加于1OX40mm （一）外周血单个核细胞 P（BMC）的分 圆形平底聚苯乙烯塑料小管内 上（海塑料九厂 离 参照B勿um的经典方法Cal［，以每毫升20 出品），因而每管培养液总量为0.5毫升。细胞 单位肝素抗凝，静脉抽取正常人外周血，然后用 加人后，加盖、摇匀，即把培养管倾斜 450, 1-2倍量新鲜配制的Hanks液稀释。取 10毫 放置于含5%0o二氧化碳的湿润空气培养器内， 升试管放人3毫升灭菌 Ficoll-Hypaque白细胞 37℃培养6天。塑料管灭菌主要是通过酒精 分离液 （比重 1.077，上海试剂二厂出品），上加 浸泡和紫外线照射，经此处理很少造成污染，塑 5-6毫升经稀释的外周血，400g约2（,000rpm) 料管对细胞无毒性。 离心15-20分钟。小心吸取分离液界面上白 （四）同位素标记及样品测定 培养终 色细胞层，即为仅含淋巴细胞及大单核细胞的 止前16小时每培养管加人氖化胸腺嚓咤核昔 PBMC （中性粒细胞污染在本实验中一般低于 1微居里 （比活为5居里／毫克分子，上海原子 3外），经Hanks液洗两次以后，重新悬浮于含 核研究所出品）。收获的培养物用国产49型玻 或不含血清的培养液中计数。 璃纤维滤纸 上（海红光造纸厂出品）过滤+3，洗 培养液为 RPMI1640，另加 L一谷氨酞胺 ZhouGuangyanetal.:ASemi-microTechniquefor 2mM，青霉素 100单位 ／毫升，链霉素 100微 OneWayCultureofMixedLeucocyte 13 去细in外游禽的同位素并固定细胞后，把嵌有 胞也能适应常规的无菌操作，为本实验系统所 细胞的纤维滤纸小纸片烘干，放人适量液体闪 采