第三章 凝胶过滤层析.ppt

（5）洗脱：控制流速15 d/min，开始洗脱，在检测仪上观察到开始出峰时开始收集。将收集的蛋白峰液体放置冰箱，准备进一步用DEAE-纤维素柱层析纯化。 思考题 1、凝胶过滤层析分离大分子物质的机制是什么？ 2、分子质量为8×104和10×104的蛋白质能否在SephadexG-75柱中分开？为什么？ （SephadexG-75的分离范围为300070000） 3、在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为140ml，其外水体积和总体积分别为60ml和200ml，求分配系数是多少？ 4、制备合格的凝胶柱应注意哪几点？ 5、概述哪些因子影响凝胶层析的分辨率？为什么？ 可能有同学问，那么中间大小的物质就分成两块了，一部分先流，一部分后流？不是。因为这些分子在下流过程中时而进入，时而在外，这样整体上每种物质的各个分子物质流速一致 所以G10 回忆排阻极限的定义。 聚丙烯酰胺有挥发性，致癌。操作与page相同的原理 根据我们的目的选择凝胶。提问，组别分离和分级分离应该用什么排阻极限的凝胶？ 由于分子量接近，不可能做到完全排阻一种而阻滞另一种，所以，分级分离时，略大于最高分子量，这样各组分均能不同程度的深入到胶孔，只是程度上的差异，这样洗脱体积不同得到分离。 组别分离，将样品中的大分子物质与小分子物质分开。脱盐就是一种组别分离。 其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 分级分离，将样品中一些分子量比较接近的物质分开。 策略是使在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。 1）凝胶型号的选择（根据分离的目的） 组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50(3*104 Da)，脱盐一般选用G25（1000-5000Da）。 分级分离一般选用排阻极限略大于样品中最高分子量物质的凝胶。 2）粒度的选择 目数（反映凝胶颗粒直径的大小）。目数越大，直径越小。 每种型号凝胶都有有粗粒和细粒之分。 细粒均一性好，分离效果好，但是流速慢，适合小型实验。层析柱选用大直径的； 粗粒的优势是流速快，适合样品量大的实验，选用小直径的柱子提高分辨率。 凝胶粒度与洗脱效果的关系图 3）不同凝胶类型的选择 琼脂糖凝胶、Sephacryl LH-葡聚糖凝胶 琼脂糖凝和Sephacryl 大分子分离 亲脂分子 规模大，流速快 其他因素如洗脱液的酸碱度 根据各种凝胶的性质选择 4）凝胶用量的计算 二、 凝胶的处理 将所用的干凝胶慢慢倾入5、10倍的蒸馏水中，参照凝胶说明书溶胀所需的时间进行充分浸泡，并除去悬浮的小颗粒。 再用0.5mol/LNaoH—0.5mol/LNaCl溶液在室温下浸泡0.5h，抽滤除去碱液．用蒸馏水洗至中性。 为了除去凝胶颗粒空隙中的气泡，可把处理过的凝胶浸泡于蒸馏水或平衡液中用抽气方法实现。 三、 凝胶柱的制备 1）柱的选择 长层析柱分辨效率高于短柱。理想的直径和长度之比是1：25－1：100 根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内。 2）装柱 干装法 容易产生气泡 湿装法 先将适量溶剂加到柱中，将浸泡好的凝胶缓慢倒入，一直浸泡在溶剂中，沉降至柱高1/4－1/3时打开下端出口，溶剂流出。 3）鉴定柱的质量 用带色的物质或蛋白质过柱均匀下降即可。 细胞色素c、血红蛋白等物质配成2mg/ml的溶液过柱。 四、加样 （1）加样体积越小，分辨率越高。 两种蛋白洗脱体积为VeA、VeB，两种蛋白分离体积Vs（洗脱体积之差），Vs＝VeA-VeB, 理论上，Vp(加入样品体积）＝Vs时就能分离两种蛋白质 VpVs时效果好。 （2）样品粘度的影响 五、 洗脱 洗脱液：能溶解被洗脱物质、不使其变性或失活为原则。 一般都以单一缓冲液(如磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液等)或者盐溶液作为洗脱液。 有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液。 影响流速的因素 洗脱液加在柱上的压力 凝胶交联度 凝胶颗粒大小 流速过低 样品横向扩散增大，峰变宽，分辨率降低，洗脱时间长 流速过高 洗脱峰重叠，柱压增大，分离效果变差 线性流速控制在2～10cm/h 六、凝胶柱的再生和保存 用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行，处理后重新装柱即可再使用。 第四节 应用 脱盐 高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中含有的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐