玉米原位转化体系建立和转化机制初步分析.pdf

摘 要 近年来农杆菌介导的植物原位（In Planta）转基因技术体系已广泛用于拟南 芥、白菜、油菜、苜蓿等多种植物的转化中，但在单子叶植物玉米上的应用少见 报道。本研究以玉米骨干自交系郑 58作为转化受体材料，应用正交实验设计， 研究建立玉米原位转化体系并进行技术参数优化；同时利用 GUS报告基因的瞬 时表达技术分析了玉米原位转化中农杆菌侵染途径及位置等。获得如下主要结 果：  1.  初步建立了玉米原位转化体系，主要流程如下：A.农杆菌培养及转化液 制备；B. 原位转化：在玉米初花期（雌穗花丝露出苞叶 3­5cm，雄穗未散粉）， 将农杆菌菌液注入雌穗，待成熟期收获种子；C.除草剂抗性筛选：将收获的  T0  代种子进行除草剂抗性筛选；D.抗性植株 PCR 分子检测。  2.利用正交实验设计，对影响农杆菌转化效率的主要因素进行优化，同时分 析这些因素对转化后的玉米烂穗率以及结实率的影响， 最终确定了玉米原位转化 体系的最佳转化参数。结果表明，Silwet L­77 是影响转化效果最关键的因素，高 浓度的 Silwet  L­77 会降低结实率；其次是菌液浓度，且菌液浓度对玉米的烂穗 率、结实率影响较大；高浓度的蔗糖会增加烂穗率。在菌液浓度为 OD =0.9， 600 v  蔗糖浓度=30g/L，转化介质中加入 0.03 （ / ）浓度的 Silwet  L­77 时，PCR 阳性 v 率最高达到 2.38%。  3.  应用 GUS基因瞬时表达技术对玉米原位转化中农杆菌侵染途径及位置进 行组织化学分析，结果显示：GUS 基因表达最早见于子房组织，随着侵染时间 的持续，连接子房与花序轴的小穗部位以及花序轴也能观察到染色，最终观察到  GUS 基因转化的幼胚，表明农杆菌最先侵染子房，同时会侵染生殖组织以外的 组织并能获得转化的幼胚；中上部花序的子房 GUS 基因瞬时表达率较基部子房 组织高，表明转化事件容易发生小花发育早期时候，证实转化发生在玉米雌花序 成花早期，适当的提前转化期可以提高转化率, 这些结果为玉米原位转化方法有 效性和转化机制提供了重要的组织化学的实验依据。 关键词：玉米；原位（In planta）转化；正交设计；GUS染色 I Abstract  In  recent  years,  Agrobacterium­mediated  in  planta  transformation  has  been  widely used in Arabidopsis thaliana, chinese cabbage,rape,and alfalfa. However, the  application in monocotyledon such as maize genetic transformation is rarely reported.  The leading maize  lnbred line Zheng58 was used as receptor in this  study, used  orthogonal design, in order to set up the system of in planta transformation that is  stable  and  efficient.  Meanwhile,  optimum  conditions  to  clear  up  transformation  system. Then, the transient expression of GUS gene based on this transformation  system  was  used  to  study  the  problems  where  Agrobacterium  to  enter  the  inflorescence and the pathway of infection forAgrobacterium，