Western Blot操作解析课件.ppt

生物化学与分子生物学实验 细胞与分子生物学实验教学平台 Western blot (immunoblotting) 步骤： 优点： 高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应 1-5 ng中等大小的靶蛋白 蛋白提取 Total protein – standard lysis buffer（lipa） Nuclear cytoplasmic extraction (NER-PER, extraction kit, Pierce) To prevent degradation always centrifuge samples at 4℃and include a protease inhibitor ? Protein Qantification : Standard BCA assay (Pierce) Bradford reagent SDS不连续电泳 Poly Acrylamide Gel Electrophoresis（PAGE）is the best method in protein separate。 Use PAGE to separate proteins by MW。 SDS： 阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。 蛋白质-SDS胶束的特点： PAGE：聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式： 影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素 试剂的纯度 温度 氧气 〔AP〕〔TEMED〕原则：尽量少的催化剂并在最佳时间内聚合。 凝胶浓度的选择 不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。 不连续电泳： 浓缩效应： 配制： 灌制分离胶 隔绝空气 电泳后染色 蛋白质的电转移（electrotransfer blot) 半干式转膜 注意： 转移单元无气泡 注意方向 戴手套，防止引入污染蛋白 胶、膜大小一致，半干转注意短路。 膜、滤纸要先平衡 20%甲醇改善电转移效果。 转移效果： Ponceau-S Red 固相支持物的选择： 硝酸纤维素膜（nitrocellulose, NC) NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小； 非特异性本底显色浅； 价格低廉，使用方便。 结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。 Polyvinylidene fluoride (PVDF) 与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡,以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。 封闭： -5% BSA或non-fat-dry-milk (RT or 4℃) -incubation time : 60 min - O/N Tween-20的作用：减少非特异性吸附不影响 抗体与抗原的结合 靶蛋白的免疫学检测 Poor Transfer Adjust composition of the transfer buffer Methanol SDS Transfer of a range of proteins with different molecular weights Transfer of a broad MW range of proteins may require a multi-step transfer. Start at low current/voltage to give good binding of low molecular weight proteins After 30 minutes increase current/voltage to promote elution of high molecular weight proteins Citation: Two Step Electrotransfer Procedure - T. Otter et al, Anal. Biochem. 162: 370-377 (1987) Primary antibody dilution: higher specificity Secondary antibody dilution: lower backgr