westernblot操作规程-相关试剂配制.docVIP

8SDS电泳 适用与Bio-Rad Mini Protean 3类电泳槽 一、准备工作 1 试剂 蛋白marker；丙烯酰胺双丙烯酰胺 Tris碱；甘氨酸 甲醇 冰乙酸SDS；过硫酸铵甘油 溴酚蓝β-巯基乙醇考马斯亮蓝 R-250 TEMED；正丁醇））Separating gel所需各成分的体积 / mL 15% 12% 10% 2 gels 1 gel 2 gels 1 gel 2 gels 1 gel 30% acrylamide mix 10 5 8 4 6.66 3.33 1.5M Tri, pH 8.8 5 2.5 5 2.5 5 2.5 ddH2O 4.8 2.4 6.8 3.4 8.04 4.02 10% SDS 0.2 0.1 0.2 0.1 0.2 0.1 10% APS 0.1 0.05 0.1 0.05 0.1 0.05 100% TEMED 0.01 0.005 0.01 0.005 0.01 0.005 Total 20 10 20 10 20 10 （注：先加入，然后再从冰箱取出加入） 3. 加入APS和TEMED后，轻轻振荡烧杯使其混匀。 （注：一定要将加入的溶液充分混匀，以免胶凝固的不均匀） 4. 小心地用移液器将分离胶沿隔片加入模具。 （注：动作缓慢，以免产生气泡） 5. 当加入的凝胶溶液7.4 mL时，轻轻在溶液上覆盖一层1 mL正丁醇饱和的水，使胶面平整。 6. 等40 min，待凝胶聚合后，在分离胶和水之间会出现一个清晰的界面。 （注：此时可制备蛋白样品。具体见“c. 样品的制备”） b. 灌制浓缩胶 浓缩胶配制所需组分如下：按3.9%配制 配制Stacking gel所需各成分的体积 / mL 5% 3.9% 2 gels 1 gel 2 gels 1 gel 30% acrylamide mix 1.7 0.85 1.3 0.65 0.5 M Tri, pH 6.8 2.5 1.25 2.5 1.25 ddH2O 5.7 2.85 6.1 3.05 10% SDS 0.1 0.05 0.1 0.05 10% APS 0.05 0.025 0.05 0.025 100% TEMED 0.01 0.005 0.01 0.005 Total 10 5 10 5 倒出并用滤纸吸干覆盖在分离胶表面的水层。 （注：先加入，然后倒出水，最后再从冰箱取出加入） 加入APS和TEMED后，轻轻振荡烧杯使其混匀。 小心地用移液器将浓缩胶沿隔片加入模具，直至凝胶到达模具的顶部。 斜着插上梳子。（注：动作缓慢，尽量不要产生气泡） 放置30 min左右，待凝胶聚合后，小心拔出梳子。 （注：拔出梳子时，要垂直拨出，以免损坏制好的泳道） 将凝胶放入电泳槽中，在槽中加入1×电泳缓冲液。 （注：1，缓冲液所加入的量，玻璃内液面高于玻璃外液面，玻璃内的，液面高于短玻璃低于长玻璃。 2，尽量吸尽玻璃内液面的气泡，以免电泳过程中造成短路） c. 样品的制备： 将蛋白样品和sample buffer在一1.5 mL管中混匀，于95℃加热5 min（或100℃ 3 min）。 离心1 sec，点样入泳道。 d. 电泳： 接好电极，电流应流向阳极。 150 V恒压电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部1～5 mm处终止。时间约60-75min。（注：此时配制电转缓冲液，剪NC膜和滤纸） 取出凝胶板，小心拆卸。 e. 染色与脱色： （注：此步骤按实验需要选择是否操作） 考马斯亮蓝染色： 戴上手套以免手指印留在胶上，将胶移入考马斯亮蓝溶液中，于振荡摇床上缓缓振荡染色2 h以上（一般3～4 h），染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器。 加入考马斯亮蓝脱色液，振荡脱色。 Western blot操作过程 准备工作： 1 试剂： Tris碱；甘氨酸；甲醇； 预染marker (PRO-STAINTM Prestained Protein MarkerⅠ, mbi) Whatman滤纸（普通实验室用的不行，要厚的，夹膜用的） 一抗 ；二抗； Western试剂盒 (170-5013, Bio-Rad)； 硝化纤维膜 (Amersham)； X光片 (最好是柯达的)； 显影粉 （国产，洗普通照片的即可）； 定影粉 （国产，洗普通照片的即可）； 2 仪器及耗材： 膜标记笔；电转系统；冷却系统；磁力搅拌器；水平脱色摇床； 锥型瓶（50ml,2个）—胶—膜—3张滤纸的顺序包好，并将滤纸四边按胶的大小剪掉，确保胶两边的滤纸无法接触到。 C．将包好的胶放入转移胶架中，（