纳米金标记核酸探针检测小反刍兽疫病毒核酸的研究.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（７）：８９９４ 纳米金标记核酸探针检测小反刍兽疫 病毒核酸的研究    陶春爱 　邱文英 　李　刚 　田康乐 （中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室农业部兽用药物与兽医生物技术北京科学观测实验站　北京　１００１９３） 摘要　试验旨在探讨利用纳米金标记寡核苷酸探针快速检测小反刍兽疫病毒核酸的方法。针对 小反刍兽疫病毒Ｎ基因的高度保守区设计两条特异寡核苷酸探针，一条探针５′端修饰生物素，另 一条探针３′端修饰巯基。巯基化的探针通过 ＡｕＳ键连接到纳米金颗粒上。靶核酸两端分别与 两条探针结合，形成“生物素化探针靶核酸纳米金探针”复合物，该复合物通过生物素亲和素系 统，固定在固相载体上，最后银染放大信号。通过肉眼观察法、光镜观察法、分光光度法分析银染 灰度，从而间接测定靶核酸的量。初步检测ＰＰＲＶ核酸最低浓度达１０ｆｍｏｌ／Ｌ，所需时间约为１．５ｈ。 该方法灵敏度高、操作简单，为临床检测小反刍兽疫病毒核酸提供实验数据和技术支持。 关键词　纳米金　ＰＰＲＶ　核酸探针　银染 中图分类号　Ｑ７８ 　　小反刍兽疫（ｐｅｓｔｅｄｅｓｐｅｔｉｔｓｒｕｍｉｎａｎｔｓ，ＰＰＲ）是由 ｎｍ，具有较大的比表面积、较强的化学反应活性及尺寸 小反刍兽疫病毒 （ｐｅｓｔｅｄｅｓｐｅｔｉｔｓｒｕｍｉｎａｎｔｓｖｉｒｕｓ， 量子效应，能与核酸、蛋白质等生物分子起特殊作用， ＰＰＲＶ）引起的一种严重的烈性、接触性传染病，主要感 ［３］ 且不影响它们的活性 ，因而在分子生物学领域得到 染动物为小反刍兽，其中山羊高度易感。ＰＰＲＶ是副黏 广泛使用。在纳米金颗粒上连接寡核苷酸探针检测核 病毒科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）麻疹病毒属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）成 ［４］ 酸的技术最早由美国Ｍｉｒｋｉｎ等 报道。该研究组把探 员。该病毒共有４个群，１种血清型。ＰＰＲＶ基因组为 针标记到纳米金颗粒上，使纳米金与靶核酸形成超分 单股负链无节段ＲＮＡ，从３′端至５′端依次是ＮＰＭＦ 子结构，从而引起溶液颜色变化，由此达到可视化定性 ＨＬ６个基因，分别编码６种结构蛋白（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｈ、 和定量检测核酸的目的。近几年，纳米金主要用于基 Ｌ）和２种非结构蛋白（Ｃ和Ｖ）。目前，检测ＰＰＲＶ的 因芯片、斑点杂交、电化学检测、靶向药物的研究，是研 方法主要有琼脂糖凝胶扩散实验（ＡＧｌＤ）、间接免疫荧 ［５］ ［６］ 究质量信号放大 、生物条码放大 、生物分子的细胞 ［１］ 光抗体试验（ＩＦＡＴ）、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ） 、聚 定位等的理想材料。 合酶链式反应 （ＰＣＲ）及环介导等温扩增实验 　　本研究将寡核苷酸探针标记到纳米金颗粒上，通 ［２］ （ＬＡＭＰ） 等，而还未见关于结合纳米金标记核酸探针 过探针与ＰＰＲＶ核酸高度保守区域互补杂交，再用银染 检测该病毒的核酸的报道。 放大信号。与传统的琼脂糖凝胶电泳相比，灵敏度更 　　纳米金是一种新兴的生物材料，其直径为１～１００ 高，且避免了因核酸染料引起的生物安全问题。 收稿日期：２０１１１２