基因工程11-大肠杆镜您基因工程.pptVIP

第十三章 大肠杆菌基因工程;D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策;A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征;大肠杆菌表达外源基因的劣势;B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理;启动子;启动子的构建;强化转录终止的必要性;强终止子的选择与使用;核糖体结合位点;大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它识别并与16S rRNA 3’端的3’ AUUCCUCC 5’ 专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点； SD序列与翻译起始密码子之间的距离重要而碱基组成不重要；在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处。 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基组成也较重要，这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区形成茎环结构。 ;生物体对密码子的偏爱性;使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达的策略： ; 对于那些含有稀有密码子出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用。;质粒拷贝数;质粒拷贝数;C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略;包涵体型异源蛋白的表达;以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点;包涵体表达形式的缺点：;包涵体型异源蛋白的表达;包涵体的溶解与变性：;包涵体的复性与重折叠（refolding）：;包涵体的复性与重折叠（refolding）：复性操作;分泌型异源蛋白的表达;以分泌形式表达目的蛋白的优缺点;分泌表达形式的缺点：;融合型异源蛋白的表达;以融合形式表达目的蛋白的优缺点;融合型目的蛋白表达系统的构建;融合型目的蛋白表达系统的构建;目的蛋白的回收;目的蛋白的回收;目的蛋白的回收;目的蛋白的回收;目的蛋白的回收;寡聚型异源蛋白的表达;以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点;寡聚型目的蛋白表达系统的构建;整合型异源蛋白的表达;DNA体内重组的基本原理; 在原核细胞中，染色体DNA链上的两个同源区之间可发生同源重组。距离越远、长度越长、同源性越高，重组的频率也就越高，反之亦然。 同源重组有整合和交换两种形式;同源序列依赖型的体内重组：同源整合;同源序列依赖型的体内重组：同源交换;蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建; 大多数不稳定的重组目的蛋白是被大肠杆菌中的蛋白酶La和Ti降解的，两者分别由lon和clp基因编码。lon-的大肠杆菌突变株可使半衰期较短的细蛋白稳定性大增，因此被广泛用作外源基因高效表达的受体菌。; 大肠杆菌中的热休克蛋白可胁迫异源蛋白形成一种对蛋白酶降解较有利的构象，从而提高异源蛋白对蛋白酶的敏感性。lon-htpR-的双缺陷株非常适合高效表达不稳定的重组异源蛋白。; Asp离C末端越近，蛋白质的稳定性就越大。在蛋白质C末端引入Asp，能显著延长半衰期。; 多肽链的N末端序列中含有较高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，稳定性显著改善。 N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr，半衰期通常很短。尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是蛋白酶的超敏感区。;D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策;基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制;改善基因工程菌不稳定性的策略;施加选择压力;控制目的基因的过量表达;E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素;胰岛素的结构及其生物合成;人胰岛素的生产方法;人胰岛素的生产方法;人胰岛素的生产方法;基因工程法制人胰岛素;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;表达产物的后处理路线：;A链和B链分别表达法;第二种基因工程菌的构建战略：;表达产物的后处理路线：;生产技术的评价：;A链和B链同时表达法;分泌型重组人胰岛素表达法