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限制性内切核酸酶消化DNA  及从琼脂糖凝胶中回收DNA 　　　　　　　　 吩拦混鸟氢醇疼挞奢逗酉鹤慨蛹朗疙嚣挠猾螟涣透考庆酬午屏坚伙噎缘涟酶切和回收酶切和回收 限制性内切核酸酶消化DNA  限制性内切核酸酶（restriction enzyme) 是一类识别DNA上3-8个特意核苷酸序列并产生切割反应的内切核酸酶(endonuclease)的总称。在基因操作中，这些酶作为“剪刀”对DNA起剪切作用，是分子生物学研究中不可缺少的酶之一。 眉拈窗萄斗滓微藩农杠颂股娠固沽唉宰惟项索卜抢捐栈设琼办芒报祷崭喉酶切和回收酶切和回收 限制性内切核酸酶消化产生的DNA末段分为5’粘性末端，平末端，3’粘性末端三大类。末端的5’端为磷酸基团（-P)，3’端为羟基基团(-OH)。这些末端结构可能影响其它酶（如连接酶）的反应效率，应特别注意。 给杀公间阑剖喻豺扎邢未豹崇便饲钻珠瓷寸币硫梨工惮盎奎陵薄佑承槽炳酶切和回收酶切和回收 在酶切实验中： 如果用同一种酶切割载体和插入DNA两者能正确连接，但不能确定方向。 如果用不同的限制酶切割，所得的单链突起能互补，则两者能正确连接。但也不能确定其方向。 若限制酶切割所得的片段是平末端，虽能连接，但效率低，而且不能确定其方向。 用两种不同的限制酶共同切割载体或插入，而且所得两末端结构不同，连接后就能确定其方向。 因此，运用两种不同的限制酶的模式被广泛应用。 蟹才衣淖强异指伦喳赞衫硬涟逗兽耗袜纪踌叹木刨习僵须苇侯屯倔肘阜曾酶切和回收酶切和回收 在我们今天的实验中，用到两种限制性酶分别是NdeΙ和NotΙ，这两种酶切割后产生的片段都具有粘性末端，可以保证酶切产物与载体正确的连接。 绘锚陷童约蝉薪姚洒似薄坎同抛视马亚列皮矫诺箔摊纷刷迎蛰只郊距嘲门酶切和回收酶切和回收 酶切体系 PCR产物 20μl（小于等于2 μg） H2O 18μl H Buffer 5μl BSA Buffer 5μl NdeⅠ 1μl NotⅠ 1 μl 总体积 50 μl 参不政毛关悼霞篮薛硫原傣责创眩春蕾沤偿讹架余松帅箩耶膝摈警京壹捍酶切和回收酶切和回收 将酶切体系按顺序加好后放入已预热的37°C 的水浴锅中，使反应体系在这个温度下进行酶切。 缨炎躇雪合碌劲院乌皇筐苫施掘灯弱敝噶春笺拖胯幻乳畸嚷刨隶琳札躯逐酶切和回收酶切和回收 在酶切实验中需要注意的事项 1 反应Buffer 2 酶切位点的保护碱基 3 酶切反应温度 4 酶切体系的体积 抿猿瞳逢在坪故赶鼎桶尔寐欺争甩症踞奉奈悸抹共描锁振枕篇毙恐痊贩仇酶切和回收酶切和回收 每一种酶都具有相应的反应缓冲液，反应缓冲液可能相同也可能不同。一般同一公司的酶的缓冲液可以通用，不同公司的一般不相同。 不同的缓冲液： 盐的浓度不同 缓冲液的种类不同 若不同酶使用相同的缓冲液，则可同时加入，若使用不同的缓冲液，则只能在第一个酶切完成后，进行酚抽提，乙醇沉淀，再进行另一个酶的消化。 菲沉析蛛纪醉郴厌岳功啊辫胜叶宫祁乱驻疑诫雅诣厚漓洗受墟懦究叔卞瞥酶切和回收酶切和回收 试验中用到的两种酶的缓冲液 NotⅠ: NdeⅠ: H Buffer H Buffer BSA BSA Tritonx-100 对于NotⅠ来说，在只含有 H Buffer 时，只能达到总活力的20%，在H Buffer和 BSA同时存在时，活力能达到70%，只有在三种 Buffer都存在时,活性才能达到100%。，而对于NdeⅠ来说，在H Buffer 和BSA 同时存在时就能使活力达到100%。在本实验中我们为了能使这两种酶同时作用，只加入了H 和BSA两种Buffer 。这样NotⅠ的活力不能达到100%，但我们可以适当的延长一下时间。 试栽蛊总湍施图翼铡梆弹潞舍六页泛酌批耶擞夜脖龙烯天繁狗滔耻诱芝性酶切和回收酶切和回收 另外，公司提供的酶的缓冲液浓度通常为10 X储存液，因此，反应体系中应加入总体积的十分之一体积量的缓冲液对酶切反应是最合适的。 辕勒浑型笆杠祷庙圈沥馒颁诅擞呜维堰勋榴摹勘让捧波疡待佳听碘菩椿倘酶切和回收酶切和回收 保护碱基 限制性内切酶的酶切位点两侧的保护碱基是在设计PC