西南印度洋洋中脊热液羽流微生物多样性.doc

西南印度洋洋中脊热液羽流微生物多样性摘　要：西南印度洋超慢速扩增洋中脊（SWIR）在全球热液系统中起着举足轻重的作用，是目前热液研究的热点，同时也是地球科学研究的焦点之一。本研究提取了SWIR热液羽流样品的DNA，分别构建古菌、细菌16S rDNA克隆文库，通过RCR分析与序列测定，分析微生物的群落结构与环境相关性。结果表明，样品中的细菌全部为变形杆菌（Proteobacteria）和拟杆菌（Bacteroidetes），其中黄杆菌（Flavobacteria）为优势种群，而?%\-proteobacteria具有较高的多样性，另外还有少量的?%Z-proteobacteria、?%[-proteobacteria。样品中的古菌序列绝大多数（82%）属于泉古菌（Crenarchaeota），主要与Maring Group Ⅰ具有亲密的亲缘关系，此外还存在硫化叶菌（Thermoprotei）、热变形菌（Thermoproteales）以及Maring GroupⅡ。系统发育分析表明：西南印度洋洋中脊热液羽流中具有丰富多样的微生物群落。 关键词：热液　羽流　微生物分子生态　西南印度洋洋中脊 中图分类号：Q93　　　　　文献标识码：A　　　　　文章编号：1007-3973（2012）003-094-041 前言 自从1977年美国深海探测器“阿尔文”号在加拉帕戈斯大裂谷深处首次发现热液喷发，一个以化能合成为基础的“黑暗生物圈”震惊了整个生物界和地学界。热液从海底喷口喷发，与含氧的深海海水混合，高浓度的无机物为微生物生长繁殖提供了大量的能源和物质，引发微生物旺盛的化能合成新陈代谢，维持着高丰度多样性的生态系统。虽然近喷口的环境得到了广泛的关注，但是分散消耗更多地热能距离喷口数百米连绵数百公里的热液羽状流却没有得到足够的重视。在羽流中，氢气、甲烷、氨、硫、铁、锰等都存在强烈变化，它们不仅为化能无机自养提供能源，并且是深海有机碳的重要来源。因此，通过热液羽流微生物对物质能量的作用，一个从海底到海表，从岩石圈到生物圈新的海底生态系统诞生了。 现代分子生物学方法尚未广泛应用于深海热液羽流，因此对羽流微生物的习性、来源以及生态还知之甚少。早期研究显示了羽流中微生物相对于背景海水其生物量增加，微生物活动增强，而最近的研究则渐渐了解了一些特定微生物的生态特征，例如厌氧氨氧化细菌。然而，并没有研究从根本上解决深海热液羽状流微生物生物地球化学过程的本质。要解决这个关键的问题就必须了解热液羽流中微生物的生态群落结构及其环境制约的具体体现。 本文对西南印度洋洋中脊热液羽状流进行科考采样，通过16S rRNA序列测定以及系统发育分析，对其中甲烷异常层热液羽流中的细菌、古菌的系统发育树进行分析，并加以初步总结。 2 材料和方法 2.1 采样地点　　样品位于西南印度洋洋中脊水深约2800m的甲烷异常热液羽状流。西南印度洋洋中脊（SWIR）是非洲板块和南极洲板块之间的主要边界，从西端的布维三联点（Bouvet Triple Junction, BJT）到东端的罗得里格斯三联点（Rodrigues Triple Junction，RTJ），全长约8000km。按几何形态和扩张历史，将SWIR从西至东分为7段，采样点位于Marion转换断层和Gallien转换断层之间的第五段，隆起相对较高，轴向深度相对较浅，是全球为数不多的超慢速扩张的洋中脊之一。 2.2 采样方法 样品经由SBE 19plus CTD（sn：5120）采集之后，选取羽流层2L水样真空抽滤过0.22um微孔滤膜，收集滤膜在2ml EP管中，冷藏保存于-80℃。 2.3 基因组 DNA的提取 实验采用gDNA Extraction（DNA物理提取）方法，通过加入适量DNA提取Buffer后，将EP管反复放入液氮和65℃水浴锅中进行破壁，加入适量蛋白酶、SDS，而后按照酚仿—氯仿—异戊醇的顺序进行抽提转移，最后重复使用乙醇进行洗涤，转移加入100?%el灭菌水入EP管保存于-80℃。Extraction buffer包括：100 mM Tris-HCl (pH 8)；100 mM Na2-EDTA；100 mM NaH2PO4 (pH 8)；1.5 M NaCl；1% CTAB。 2.4 PCR体系与程序 实验采用Biometra公司Tprofessional Thermocycler型PCR仪，使用Di Cello F提出的50?%el PCR体系，包括：DNA模板，2 ?%el（10-20ng）；双向扩增引物，2?%el；Taq DNA聚合酶，2?%el；2.5mmol/l dNTP，4?%el；10?譖CRbuffer，5 ?%el；25 mmol