FLIPRTETRA系统检测Gi-和Gs偶联GPCR介导的第二信使cAMP.PDF

FLIPRTETRA 高通量实时荧光成像分析系统应用系列 （5 ） FLIPRTETRA 系统检测Gi-和Gs 偶联GPCR 介导的第 二信使cAMP 信号变化 简介 在这篇应用文献中我们展示了基于Promega 公司 GloSensor™ 如图1 所示，Glosensor cAMP 检测实验主要通过cAMP 结合域融 cAMP 实验中的修改后的发光萤火虫荧光素酶的应用。在 合到野生型的萤火虫荧光素酶的N-和C-末端来实现。cAMP 缺 FLIPR® Tetra 高通量筛选系统进行cAMP 水平的检测以保证在动 乏时，基因修饰过的含有cAMP 结合域的荧光素酶处于未激活 力学模式下精确检测Gi 和Gs 偶联的GPCR 活性。通过这样的 状态。一旦结合了cAMP 后，cAMP 结合域构象发生变化处于激 实验，基于对细胞内相关第二信使cAMP 浓度变化的检测可以 活状态引起化学发光信号增加，从而被FLIPRTetra 系统检测到。 对GPCR 亚型进行评价。Gi 和Gs 偶联GPCR 的第二信使信号 更多关于Glosensor cAMP 实验的信息可参考技术手册（Cat# 活性的检测传统方法一般采用放射性结合或需要细胞裂解的 TM076, Promega ）。 终点法cAMP 实验方法。这些类型的实验都是检测一个单独时 结合质粒瞬时转染或稳定转染的灵活的G -和G -偶联的GPCR s i 间点下的细胞反应和活性，不能提供动力学信息。另一种选 择时采用强制耦合到G 的G -和G - GPCRs，检测受体激活 实验设计是可行的。四种可供选择的来自Promega 的细胞系或 16 s i 后钙离子流引发的荧光信号检测。然而，这种方法由于不是 靶标细胞系见下： 直接的反应cAMP 通路生物相关性信号变化，只能作为第二位 灵活的GloSensor cAMP 实验设计 • Stable receptor and stable GloSensor cAMP assay 选择。我们展示了稳定表达Glosensor 质粒的CHO-K1 和 • Transient receptor and stable GloSensor cAMP HEK-293 细胞系中的内源性受体活性。另外，在瞬时转染了 assay Glosensor 质粒的细胞系中检测了稳定转染的G -和G -偶联受体活 s i • Stable receptor and transient GloSensor cAMP 性。结合Glosensor cAMP 方法，FLIPRTetra 系统建立了一个灵活 assay 的完整解决方案用于GPCR 主要亚型的动力学筛选。 • Tra