第4章-植物离体无性繁殖和脱毒技术-2012-11-01.ppt

* * 苹果茎沟病毒昆诺藜鉴定 苹果茎沟病毒苋色藜鉴定 小叶嫁接法 取待测植物小叶嫁接到指示植物叶上，根据被嫁接指示植物叶上有无病毒症状，鉴定待测植物病毒。 每株指示植物至少嫁接2片小叶，若待测植物有病毒，嫁接后15～25d，即会产生症状。 若待检植株染有病毒，则在嫁接后1.5~2个月，在新展开的叶片、匍匐茎上出现病症。 （3） 抗血清（antiserum)鉴定法 血 清鉴定法可以鉴定专一的病毒，也可以对病毒做定量分析，但有些病毒无法获取抗血清。 基本原理是用化学处理方法将酶与抗体（或抗原）结合，制成酶标抗体（原），这些酶标记物仍保持其免疫活性，能与相应抗体或抗原特异结合形成酶标记免疫复合物，遇相应底物时，免疫复合物上的酶催化无色的底物，降解生成有色产物或沉淀物，前者可用比色法定量测定，后者可肉眼观察或通过光学显微镜识别。 （4） 酶联免疫吸附分析法（ELISA） 病毒抗血清在诊断上的局限性 一般黄化型病毒，或严格由专化性昆虫传播的病毒（如马铃薯卷叶病毒）极难或不能获得抗血清。 病毒在寄主体内含量太少，而提纯过程中丧失又太多，或在提纯过程中病毒质粒丧失了必备的抗原结构。 植物体内具有单宁物质，单宁与病毒结合，使病毒丧失了抗原性质。 （5）电子显微镜鉴定法 可以直接观察有无病毒微粒的存在，病毒的大小、形态和结构。 负染电子显微镜技术 病毒粒子与一种重金属溶液（如磷钨酸钠）相混合，然后在一个支持膜上风干。这样，病毒体就可以在暗背景上显现出来。可以直接观察病毒微粒形态和结构。烟草花叶病毒是第一个在电子显微镜下被观察到的病毒。 （6）PCR检测法 病毒交叉保护现象 是指一种病毒的存在可使寄主植物有能力抵抗另一种病毒。 脱毒后的植物的感病性反而增强，会感染上致病性更强的病毒或真菌。其原因可能是寄主植株的营养和生理状态发生了改变。 日本曾经用通过茎尖培养得到的脱毒原种取代了受马铃薯X病毒（PVX）侵染的马铃薯品种后，造成了花叶病的严重泛滥。 植物对病毒的衍生抗性 当一株植物先被非致病性的病毒感染后，会呈现出对其它致病性病毒的抗性（不是由于免疫）。 如人们将TMV包膜蛋白基因转化植物，然后让TMV进行侵染，结果显示，转基因植物对多种类型的TMV都有抗性。 （1）嫁接繁殖 （2）扦插繁殖 （3）压条繁殖 （4）葡匐茎繁殖 （5）微型块茎（根）繁殖 4.3.5 无毒原种苗的繁殖 无病毒苗繁育生产体系 国家级（或省级）脱毒中心 无病毒苗繁育基地 无病毒苗栽培示范基地 作物无病毒化生产 大蒜无病毒株系生产体系 隔离保存 无病毒苗的保存 长期保存 将无病毒苗原种的器官或幼小植株接种到培养基上，在低温下离体保存，是长期保存植物无病毒原种及其他优良种质的方法。 1．低温保存 茎尖或小植株接种到培养基上，置低温（1～9℃）、低光照下保存。低温下材料生长极缓慢，只需半年或一年更换培养基一次，此法又叫最小生长法。 2．冷冻保存（超低温保存）用液氮（－196℃）保存植物材料的方法称为冷冻保存。 3. 延缓生长 在培养基中加入生长延缓剂，如B9或矮壮素，以延长继代时间。 脱毒马铃薯---------微型薯 微型薯 危害有17种之多，如X病毒、S病毒、Y病毒、M病毒、A病毒、花叶病毒、纺锤形块茎病毒等。 马铃薯病毒可使块茎产量减少50%~80%。 马铃薯病毒的种类 通过微茎尖组织培养技术能从马铃薯体内脱除PLRV、PVY、PVA、PAF、PVG、PVM、PSW等病毒。 茎尖培养基： MS， Miller + 0.5 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA + 0.2 mg/L GA3 + 2% 蔗糖 3. 脱毒苗试管保存培养基： MS+ 3% 蔗糖 +4% 甘露醇+ 0.7% 琼脂 2. 脱毒苗增殖培养基： MS+ 3% 蔗糖 + 0.7% 琼脂+0.3% 活性碳 4. 微型薯诱导培养基（黑暗条件） MS+ 50 mg/L CCC + 6.0 mg/L BA + 0.8% 琼脂 MS + 50~100 mg/L香豆素+ 0.8% 琼脂 　　香豆素 coumarin（香豆内脂）　 白色晶体 分子式为C9H6O2(双呋喃环和氧杂萘邻酮)，分子量146.15，熔点69℃，沸点：297~299℃，溶于乙醇、氯仿、乙醚，不溶于水，较易溶于热水 　　香豆素是一个重要的香料，以与葡萄糖结合的形式存在于圭亚那黑香豆中 。