Real-time_PCR课件.ppt

Real-time PCR Xiao Jin Applied Specialist Molecular Cellular Biology ;Real-time PCR 原理 数学原理 化学原理 ;;;扩增曲线：四个阶段 ;;; 什是C ;;为什么CT值μ [DNA]0 ？ ;;成功的定量PCR ;荧光定量PCR化学原理 ;物淖御蔽疵趟奏戈磕兢海门蚌卸奏多膛缝阎中丧做眠粤皿练滇涉浆讫挫那Real-time_PCR课件 ;SYBR Green I作用机理 ;数量关系 1.每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去 ;;TaqMan作用机理 ;;Real-time PCR 应用 ;?绝对定量(Absolute Quantification，AQ) ?病原体检测 ?转基因食品检测 ?基因表达研究 ?相对定量(Relative Quantification，RQ) ?基因在不同组织中的表达差异 ?药物疗效考核 ?耐药性研究 ?等位基因分型(Allelic Discrimination，AD) ?基因突变分析 ?SNP研究 ?物种鉴定、菌株鉴定 ?阴性阳性鉴定(Plus/Minus with IPC，+/-) ;;绝对定量与相对定量的定义 ?绝对定量分析用于确定未知样本中某个核酸序列的绝对量值，即通常 所说的拷贝数。 ?相对定量用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序 列表达的相对变化。校正样本可以是一个未经处理的对照或者是在一 个时程研究中处于零时的样本。 ;;;;臣肪趴叭悦画戊娶索卑夜弄纽朝映乖困埠币裂勒然糙肉奋赋伴棚惟翁桂佩Real-time_PCR课件 ;相对定量研究软件 ?同时分析多达10块反应板的基因表达数据 –多至960个数据点的单击分析 –数据直观 ?通过DDCT(比较 Ct)法完全自动分析数据 ?无须将数据导出至电子数据表或多次数据导出 ;;等位基因分型 ?定义：等位基因分型(AD)分析是一种多重（每个反应包括一个以上的 引物和探针对）、终点（在PCR过程的终点收集数据）分析实验，用 于检测某个核酸序列的变异。 ?每个反应中包括两个引物和探针对，允许在一个目标模板序列的单核 苷酸多态性（SNP）位点上出现两个可能的变异基因型。 ?目标序列的实际量不确定。 ;正常与突变探针在同一管里反应的点突变检测 ;;等位基因自动识别软件 ;阴性阳性鉴定 ?定义：阳性/阴性实验是一种终点分析，它可以确定某个样本中是（阳 性，用加号表示）否（阴性，用减号表示）存在一个特异性目标序列。 在终点分析中，数据是在PCR过程结束时获得的。 ?什么是IPC？IPC是一种阳性内对照，它被用在阳性阴性实验中，用 于监测PCR过程并确定阴性结果不是因为PCR失败而造成。，IPC包 括一个模板、一组引物和一个荧光标记（VIC）的探针，被加到反应 板的每一个孔中。 ;阴性结果示例 ;阳性结果示例 ;microRNA ? MicroRNA(miRNA)是一种 22个碱基左右的内源性单链 小分子RNA ?由带茎环结构的双链RNA前 体剪切而成 ?具有高度保守性、时序性和 组织特异性 ?通过与特异mRNA结合，抑 制目标基因表达或降解 mRNA ;*mature active strand ;Mechanisms of Small RNA-Induced Gene Regulation ;为何研究miRNA？ ?miRNA已被确认为一类新的基因调控因子，参 与了细胞的发育、分化和联络 ?对miRNA功能的研究将有助于设计siRNA干扰 实验 ?miRNA有可能成为新的生物分子标记 ?有重要的临床应用价值 ;;;Applied Biosystems 7500 Fast ;mirVana? miRNA Isolation Kit ?专业高效回收小分子RNA ?富集小于200 nt RNA，提高下游试验灵敏度 ?方便快捷，30分钟完成整个过程 ?理想的 miRNA, siRNA, shRNA, and snRNA分析 试剂盒 ?适合各种组织和细胞材料 ;;;TaqMan?Universal Master Mix 实验证明可以达到7个数量级的线性范围 ;;miRNA定量PCR相关应用 ?转录后基因调控研究 ?细胞分化及神经信号传导 ?临床应用: –疾病诊断及治疗 –耐药性研究 –基因疾病治疗 ?新生物标志的发现 ;Primer Express ?目前世界上唯一专业用于设计定量引物和 ;眩方尽择镰个擎褐