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■ 如何对合成的Oligo DNA/RNA制品进行准确定量 ■ 核酸定量普遍采用的方法是紫外分光光度法：测定核酸溶液在260 nm的光吸收，样品溶液吸收光的量(吸光度)正比于溶液中溶质的量。吸光度与溶液中核酸浓度间的转换关系依据Lambert-Beer 定律： A=ε260 C L 其中： A：吸光度(OD) ε260 ：溶液中核酸在260 nm的摩尔消光系数(单位，L/mol.cm) C：溶液浓度(单位，mol/L) L：光路长度(单位，cm) 应用Lambert-Beer定律对核酸进行定量时，必须保证测定值在核酸浓度与吸光度值呈直线关系的范围内，否则计算结果与实际浓度之间会出现偏差。 普通的分光光度计(待测溶液装在样品池中)，测定样品溶液浓度准确的直线范围通常是吸光度值在0.1－1.0之间，如果待测样品溶液浓度过大，必须进行适当稀释，以保证测定值小于1.0。同样，待测样品溶液的浓度也不能太低，如果测定值小于0.1，测定准确度会降低(测定值重复性降低)。 NanoDrop等微体积测定仪的测定原理也是紫外分光光度法，因为使用该类仪器所需样品溶液体积小，也即光路较短(1 mm或更短)，因此吸光度与样品浓度间呈直线关系的范围加大。但对NanoDrop1000，测定数据准确的范围是2－100 ng/μl(1),这个准确测定范围对于单链DNA，相当于吸光度值在0.06－3之间，对于双链DNA，相当于吸光度值在0.04－2之间.因为低浓度测定对待测溶液要求会很高，溶液中不能有任何微小颗粒，否则测定结果会偏高，因此，应用NanoDrop 1000对单链DNA进行定量时，要想获得准确的测定结果，根据我们的经验，通常最低吸光度值高于0.2比较好，也即吸光度测定值在0.2－3之间。 近些年，针对低浓度的双链DNA定量发展了荧光定量技术。因为尽管紫外分光光度法是普遍采用的核酸定量法，但此方法也存在一定缺点：紫外吸收测定没有选择性，不能区分DNA、RNA和蛋白质，测定结果也容易受其它污染物(dNTPs、盐、有机化合物)的影响，在有前述干扰物存在时，不能对核酸进行准确定量；此外，紫外分光光度法定量核酸的灵敏度也不够高。荧光定量技术可特异地定量低浓度溶液中的双链DNA，而不受溶液中存在的RNA、蛋白质等污染物的影响。例如，利用Invitrogen的Qubit(2)测定仪，结合应用Quant-iT dsDNA HS assay试剂盒，可对浓度低至10 pg/μl的双链DNA进行定量。对低浓度核酸溶液定量，Qubit的定量准确度要远远高于NanoDrop 1000。当然，Qubit测定仪也可特异地定量单链DNA,RNA或蛋白质，不过需要强调的是，对溶液中单链DNA定量时，应该选用与双链DNA不同的荧光定量试剂盒。 对常规浓度范围内(吸光度测定值在0.2－1.0之间)的合成Oligo DNA/RNA定量，Qubit的测定结果应该与紫外吸收法的测定结果一致(不同仪器之间测定结果可能会存在系统误差)。 我们提供的合成Oligo DNA/RNA制品有两种干燥方式：真空干燥或冰冻干燥，无论您收到的是哪种方式干燥的制品，溶解样品前，都需要将Tube管进行短暂离心，使样品离心至Tube管底部，再进行后续的溶解、稀释、测定等操作，这样既可保证不损失样品，同时也可保证测定结果的准确性。