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流感病毒的快速检测方法一、 RT-PCR快速诊断方法 （一） 生物安全要求 （二） 病毒核酸提取 （三） RT-PCR （四） PCR 产物纯化 （五） 流感病毒RT-PCR检测引物 二、 免疫荧光方法检测流感病毒 （一） 原理 （二） 标本处理 （三） 间接免疫荧光法 （四） 结果判断 三、 实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测 （一） 基本原理 （二） 实验试剂 （三） 实验步骤 四、 快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Tme PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RTPCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。生物安全要求生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。病毒核酸提取 实验材料及仪器 QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit（Catalog# 74104） β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol） 70% 乙醇 无菌1.5ml 离心管 10μl、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头 可调14K微型离心机 旋转混合器操作步骤 取1支无菌、无RNA酶的1.5ml Eppendorf管，加入500μl RLT。 取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）100μl，加入上述Eppendorf管中。 加5μl β-巯基乙醇，充分混匀。 加600μl 70%乙醇，于旋转混合器混匀。 从试剂盒中取出带滤膜的离心柱，并标上标本号。 将第4步的混合液体分两次（每次600μl） 吸入于滤柱中，12000rpm 离心15秒，弃收集管中的离心液。 滤柱仍放回收集管上，将第4步的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm 离心15秒，弃收集管中液体。 于滤柱中加入700μl RW1，12000rpm 离心15秒。 从试剂盒中取出一支新的2ml收集管，将离心后的滤柱转到新的收集管上，于柱子中加入500μl RPE，12000rpm 离心15秒弃收集管中液体。 滤柱放回收集管上，于滤柱中加入500μl RPE，13000～14000rpm 离心2分钟。 从试剂盒中取出一支1.5ml Eppendorf管，将滤柱转到新的1.5ml管上，于滤柱中加入30～50μl 无RNA酶的水，室温静置1～3分钟。 12000rpm 离心1分钟，弃滤柱。收集的离心液即为提取病毒的RNA，可以直接用于逆转录实验，或在-20℃以下保存，-30℃可保存3～4个月。 注意事项 试剂盒中的RPE液用前需加44ml无水乙醇，使终体积达到55ml。 所有用过的枪头、收集管放入2%次氯酸钠消毒缸中过夜。 RT-PCR 一步法 RT-PCR 实验材料 QIAGEN One Step RTPCR Kit Cat No 210212 RNase inhibitor 40u/μl（Promega） 上游引物 200ng/μl 下游引物 200ng/μl 模板RNA（Templet RNA） 实验步骤 PCR反应配置（在清洁区缓冲间，加RNA模板应在核酸室） 无RNA酶水（Rnase Free Water） 28.75μl 5×Buffer 10μl 10mM dNTP 2μl Enzyme Mix 2μl Rnase inhibitor 0.25μl 上游引物