难治性癫痫患者致痫灶中CX43表达.doc

难治性癫痫患者致痫灶中CX43表达【摘要】 目的 探讨由CX43组成的缝隙连接在难治性癫痫患者致痫灶脑组织中的表达，为难治性癫痫的临床研究及治疗提供新的思路。方法 以24例行手术治疗的难治性癫痫患者为实验组，6例脑外伤急诊手术患者为对照组，采集其手术切除的致痫灶脑组织，应用免疫组织化学方法，观察CX43的表达并与对照组进行比较。结果 免疫组织化学方法检测显示实验组CX43的表达高于对照组(P0001)。结论 难治性癫痫患者致痫灶脑组织中CX43表达增高，提示CX43所形成的缝隙连接参与癫痫活动，可能在癫痫的发生、发展中发挥重要的作用。 【关键词】 难治性癫痫;临床;脑皮质; CX43 1 资料与方法 11 一般资料 24例难治性癫痫手术患者中，男12例，女12例，男女比例1∶ 1。年龄17~58岁，平均(283±111)岁，近3个月发作频率5~40次/月，平均(153±118)，患者病程2~29年，平均(83±78)。全部病例病史均在二年以上，经过两种或两种以上抗癫痫药物系统治疗，癫痫发作每个月4次以上，经影像学、头皮长程脑电图或颅内皮层脑电图监测明确致痫灶，具有手术指征者。所有患者均在皮层电极监测下行致痫灶切除手术，切除病灶有额叶、颞叶、枕叶、海马。术后病理证实为：脑组织皮质分层紊乱，神经元分布不均，胶质细胞增生。对照组脑外伤急诊手术6例患者，女2例，男4例，男女比例2∶ 1。年龄17~55岁，平均(365±168)岁，均无癫痫发作及癫痫病史。 12 标本制作及脑组织中CX43表达的检测 采集实验组24例及对照组6例手术切除脑组织，切块并分别置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液和2%~3%戊二醛中固定。①免疫组织化学法检测(SP法)：标本行石蜡包埋、切片、脱蜡和水化后，用PBS(pH74)冲洗3次，3 min/次。对组织抗原进行热修复：pH60、001 mmol/L的柠檬酸抗原修复液中煮沸15 min。应用SP超敏试剂盒按照说明进行操作。应用DAB试剂盒配制DAB液，每张切片加100 μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3 min。自来水冲洗，苏木精复染。自来水冲洗返蓝。切片经过75%、80%、95%、95%、100%酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。实验组与对照组分别于400倍光学显微镜下，随机选取5个视野，记录镜下阳性细胞数，取其均数。 13 统计学方法 实验数据用均数±标准差(x±s)表示，两组间比较用独立样本t检验，检验水准a=005。统计分析用SPSS 130统计软件和Microsoft Office Excel 2003进行。 2 结果 免疫组化方法检测致痫灶脑组织CX43的表达 实验组及对照组脑组织中均检测到CX43的阳性细胞，主要分布在细胞膜和细胞浆，经DAB染色，神经细胞胞浆及胞膜显棕色，因不同脑区脑皮质细胞形态不同，故免疫反应阳性细胞的形态也不相同，癫痫患者脑皮质CX43抗体阳性细胞数均明显增多，而正常脑皮质细胞胞浆及胞膜CX43抗体阳性细胞表达稀少(见表1，图1~2)，差异有统计学意义。 缝隙连接是由邻近两个细胞细胞膜上相对应的半通道(hemichannel)对接而成，是目前所知细胞间惟一能直接交换物质和信息的通道［3］。而细胞间通过GJ为途径直接进行的细胞间的信息交流成为缝隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)。GJ的基本结构单位是连接子(connexon)或称半通道。连接子是由六个缝隙连接蛋白寡聚成的一种中空的亲水性的环状六聚体结构［4］。GJ中的半通道直径约15nm，允许分子量小于10 kD和直径小于15nm的小分子物质通过，如代谢分子、离子、第二信使(Ca2+，IP3，cAMP和ATP)及代谢产物如葡萄糖等通过［5］。CX是一类具有高度保守性的，由多基因编码的膜蛋白［6］。CX的组织分布具有一定的特异性，而且不同CX组成的半通道可以相互配对排列组成不同种类的细胞间GJ。不同细胞细胞膜上GJ的种类及数目分布不同，其功能也不相同。数个至数千个GJ在细胞膜上成簇出现则形成缝隙连接斑(gap junction plaque)，GJ的数量决定着斑块的大小以及GJIC的强度［7，8］。有11 种CX在中枢神经系统中表达，分别为Cχ26，Cχ29，CX30，CX32，CX36，CX37，CX40，CX43，CX45，CX46及CX47 ［9］。目前在中枢神经系统中研究较多的为CX32及CX43，CX43在中枢神经系统表达最强，主要分布在星形胶质细胞上［10］，CX32在神经系统分布最多，主要在少突神经胶质细胞表达，同时在大脑皮质、海马的锥体细胞、颗粒细胞、中脑和基底节