感受态细胞制备与重组质粒转化课件.ppt

感受态细胞的制备及重组质粒的转化 ;重组DNA技术;重组DNA技术的基本工具; 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许含有外源DNA的载体分子通过的细胞，即感受态细胞(competent cell) 。; 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。;化学的方法(CaCl2法、热休克法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热休克处理将载体DNA分子导入受体细胞。 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。;转化原理（CaCl2法）;转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体。;影响转化效率的因素;实验原理;抗Amp;实验仪器、材料;实验材料、试剂;实 验 安 排 ;一、受体菌的培养;1、取1mL菌液于1只1.5mL离心管中，置冰浴5min，10000rpm离心 1min （每班需做对照管至少1管）（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳） ； 2、弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸上，每管加入0.5mL冰预冷 的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌，置冰浴10min； 3、4000rpm离心10min，弃上清； 4、每管加入50μL冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌，冰上放置， 即为感受态细胞。;1、实验管加5μL重组质粒DNA，对照管加5μL灭菌水，轻轻 混匀，置冰浴20min； 2、42℃水浴热应激90s（精确计时），迅速放回冰浴，冷却 5min后加入1mL LB液体培养基（不含Amp），37℃ 250rpm振荡培养约1h； 3、取50μL菌液均匀涂布在LB琼脂平板上（含50μg/mL Amp， 事先做好），37℃培养过夜（12-16h）后观察结果。;对照组：;感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速（所有操作均应在冰上进行）。 为减少对细胞的机械损伤，操作时动作一定要轻柔。 菌液涂布操作时应避免反复来回涂布，过多的机械挤压涂布容易使感受态细菌细胞破裂，影响转化率。 操作过程中注意防止杂菌和杂DNA的污染。;1、影响CaCl2法转化率的因素有哪些？如何提 高转化率？ 2、如何利用抗性筛选出重组克隆？