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感受态细胞制备与重组质粒转化课件
感受态细胞的制备及重组质粒的转化 ;重组DNA技术;重组DNA技术的基本工具; 受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能允许含有外源DNA的载体分子通过的细胞,即感受态细胞(competent cell) 。; 是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。;化学的方法(CaCl2法、热休克法):使用化学试剂(如CaCl2)制备的感受态细胞,通过热休克处理将载体DNA分子导入受体细胞。
电转化法:使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。;转化原理(CaCl2法);转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体。;影响转化效率的因素;实验原理;抗Amp;实验仪器、材料;实验材料、试剂;实 验 安 排 ;一、受体菌的培养;1、取1mL菌液于1只1.5mL离心管中,置冰浴5min,10000rpm离心
1min (每班需做对照管至少1管)(从这一步开始,所有操作均在冰上进行,速度尽量快而稳) ;
2、弃上清,将离心管倒置于干净吸水纸上,每管加入0.5mL冰预冷
的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌,置冰浴10min;
3、4000rpm离心10min,弃上清;
4、每管加入50μL冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌,冰上放置,
即为感受态细胞。;1、实验管加5μL重组质粒DNA,对照管加5μL灭菌水,轻轻
混匀,置冰浴20min;
2、42℃水浴热应激90s(精确计时),迅速放回冰浴,冷却
5min后加入1mL LB液体培养基(不含Amp),37℃
250rpm振荡培养约1h;
3、取50μL菌液均匀涂布在LB琼脂平板上(含50μg/mL Amp,
事先做好),37℃培养过夜(12-16h)后观察结果。;对照组:;感受态细胞长时间处在常温状态,会严重影响到其转化率,因此应尽量减少常温操作,动作要迅速(所有操作均应在冰上进行)。
为减少对细胞的机械损伤,操作时动作一定要轻柔。
菌液涂布操作时应避免反复来回涂布,过多的机械挤压涂布容易使感受态细菌细胞破裂,影响转化率。
操作过程中注意防止杂菌和杂DNA的污染。;1、影响CaCl2法转化率的因素有哪些?如何提
高转化率?
2、如何利用抗性筛选出重组克隆?
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