文库的构建.ppt

单增李斯特菌CDAN文库的构建 专业：预防兽医学 学号：201110802 姓名：于佳佳 李斯特菌 1926年由Murray首先发现。目前已知的李斯特氏菌属有7个菌种，即单核细胞增生李斯特氏菌，绵羊李斯特氏菌，英诺克李斯特氏菌，威尔斯李斯特氏菌 ，西尔李斯特氏菌 ，格氏李斯特氏菌 ，莫氏李斯特氏菌。该菌属主要引起食物中毒的主要是单核细胞增生李斯特氏菌。 根据菌体（O）抗原和鞭毛(H)抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 。致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。 单增李斯特菌在病原学上已被公认为一种人兽共患的食源性的致病菌。李斯特菌常生活于土壤、河水、植物、屠宰场废弃物及动物源食品中( 肉、奶及其制品、海产品等)临床上李斯特菌病的病例虽不如沙门菌等食源性疾病常见，但其引起感染的病死率高达20%-70%，危害严重，已成为全球性疾病，在各国已引起食品加工企业和公共卫生监督部门的高度重视。 从1983年至今，北美和欧洲曾报道多起人类李斯特菌病的暴发，法国1992年暴发李斯特菌病，691人发病，死亡81人。?2011年9月，美国暴发李斯特菌病，共报告病例109例，死亡21例。我国在1997年，云南省某县一自然村暴发动物源性的李斯特菌病并波及到人，其中牛发病71.04%，猪发病72.01%，羊发病36.13%，动物死亡率几乎100 %，人群发病率分别为8.2 %和8.6 %。 WHO将其列为仅次于大肠杆菌O157，沙门氏菌，志贺氏菌后的第四大重要的食源性致病菌，也是必检的食源性致病菌之一，并于2000年建立了全球监测网，在世界范围内开展与食源性致病菌相关疾病的监测，其危害性，严重性可见一斑。 我国也在2000年建立了全国食品污染物监测网和食源性疾病监测网，单增李斯特菌是其中重要监测菌之一，至2005年监测网点扩大到16个省，自治区和直辖市。 单增李斯特菌主要引发人和动物胃肠炎，脑膜炎，脑炎，败血症，流产和母胎感染等。LM所引起的这些疾病类型与LM能够穿越肠道屏障，血胎屏障和血脑屏障有关。 血脑屏障由脑毛细血管内皮细胞，基膜和神经胶质构成，维持中枢神经内环境的相对稳定。脑的毛细血管与身体其他器官的血管不同，属连续型，即毛细血管内皮细胞之间以紧密连接封闭。实验证明，内皮细胞是构成血脑屏障的主要结构。因此，病原体侵入毛细血管内皮细胞可能是其穿越血脑屏障的一种重要的方式。 Kirk1933年所做的对人脑干组织的病理观察和Greiffenberg等2000年利用体外培养细胞的研究均支持这种假说。他们利用电子显微镜观察到LM不仅粘附在脑干组织的毛细血管内皮细胞腔面，而且还在脑干组织的毛细血管内皮细胞和人工培养的人脑微血管内皮细胞中定植，同时内皮细胞并没有受到损伤。 目前LM穿越血脑屏障的具体机制并不清楚。 那么LM与人脑微血管内皮细胞的哪些捕获蛋白发生相互作用了呢？ 我们用酵母双杂交法来筛选与人脑微血管内皮细胞相作用的捕获蛋白，在这之前需要构建一个人脑微血管内皮细胞的CDNA文库。 LM90株的计数，采用菌落形成单位（CFU)计数。 人脑内皮细胞的培养及计数 用细菌/细胞按照不同的比例进行侵染。 定义 CDNA:是指以mRNA为模板，在反转录酶的作用下，形成的互补的DNA。 CDAN文库：是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（CDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的CDNA克隆集合称为该组织或细胞的CDNA文库。 真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。 高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子。可见,由mRNA出发的CDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。 CDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从CDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从CDN