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线粒体单倍型与牛克隆效率的研究 STUDY OF MITOCHONDRIAL DNA HAPLOTYPE AND BOVINE SOMATIC CELL NUCLEAR TRANSFER EFFICIENCY 学 科 专 业 生物化学与分子生物学 学 号 1041809013 研 究 生 伏 静 指 导 教 师 任 兆 瑞 研究员 导 师 组 成 员 黄 淑 帧 （研究员） 曾 凡 一 （研究员） 马 晴 雯（助理研究员） 答辩日期 二0 0 七年 五月 . 线粒体单倍型与牛克隆效率的研究 摘 要 体细胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer, SCNT）是又一种 评估核发育潜能以及分析供核与受体胞质相互关系的有效手段。但目前 SCNT 的效率仍低，制约它的发展和应用。研究表明，移植于卵母细胞质 中的供核基因获得准确的重编程是保证克隆胚胎的形成、发育以及个体 的正常生长等的关键。基因重编程过程中一系列生物学功能的变化则是 核－胞质相互作用的结果。核－胞质的相互关系成为SCNT 重编程研究的 重要的内容。卵母细胞胞质中的线粒体（mitochondrion, Mt）受核基因 组和线粒体基因组的双重控制，这为研究核质互作提供了非常良好的研 究对象。由于线粒体基因组的高突变率，引起不同种群间及同一种群不 同个体间 mtDNA 序列的差异，表现出不同的单倍型，国内外研究表明， mtDNA 单倍型与牛体外胚胎生产（IVP）效率有关。 本课题通过聚合酶链式反应（PCR）与限制性内切酶片断长度多态性 （RFLP）相结合将实验动物按照外周血 mtDNA 的限制性酶切图谱划分为 A、B、C、D 四种线粒体单倍型，并选择在群体中分布较多的A 型和C 型 . 实验动物作为主要研究对象，通过活体取卵（Ovum Pick-Up，OPU）获得 卵母细胞，并培养不同类型的牛耳成纤维细胞和卵丘细胞作为供核者， 进行核移植。结果显示同型核移植的囊胚发育率明显高于异型核移植 （45.0% 和29.0%，p0.05）。证明供核细胞与卵母细胞线粒体单倍型是 否匹配对核移植效率有影响。并进一步发现，当卵母细胞与供核细胞同 为 A 型时，克隆囊胚的发育率最高（53.4%），明显高于其他组合方式 （C-C,A-C,C-A,分别为41.8%，34.3%和24.4%，p0.05），提示此种组合 方式最有利于克隆胚胎的发育。 为深入了解同型与异型的克隆囊胚之间的差异，进一步揭示核质互 作的机理，我们分别将同型与异型核移植所得的囊胚进行 H3-K9 甲基化 分析。结果显示，同型胚胎中正常甲基化的比例与 IVF 胚胎相似 (40% vs.75%,p0.05)。 本课题将分子生物学技术与胚胎工程技术相结合，针对体细胞克隆 重编程中核－质互作的关键问题，通过活体取卵（OPU）对遗传背景清楚 的卵母细胞进行研究，并从表观遗传的角度深入探讨克隆机理，