SDS-PAGE蛋白电泳手册程序.docx

蛋白电泳手册SDS及Western?blot??蛋白电泳蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg)，分辨率高，凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用。PAGE原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺?(简称Acr)?和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。?聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。SDS原理SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS?复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。实验使用过程中，还加入DTT或者***，以打开蛋白间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。SDS—PAGE最常采用垂直板不连续系统（分离胶与浓缩胶）。?索引蛋白电泳（SDS）……………………电泳试剂总表……………………………………………………制胶………………………………上样及电泳……………………染色蛋白提取蛋白定量Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明Lowry蛋白浓度测定试剂盒使用说明蛋白分子量标准（图）考马斯蛋白胶快速染色液Western?blotWestern?blotting?DAB检测试剂盒Western?blotting?ECL化学发光检测试剂盒Western?blotting?试剂盒使用说明?????蛋白电泳试剂（部分试剂可以相互替换）系号货号名称1T8060TRIS??三羟甲基氨基甲烷2G8200Glycine???甘氨酸3S8010SDS???十二烷基硫酸钠4A8080Acrylamide????丙烯酰胺5M8200N,N-Methylene?Bisacrylamide甲叉双丙烯酰胺6A8090Ammonium?Persulfate???过硫酸胺7D8220DTT???二硫苏糖醇8M8210β-Mercaptoethanol??β-***9T8090TEMED???四甲基***10A101030%丙烯酰胺（29:1）11S10514XSDS分离胶缓冲液（PH=8.8）12S10524XSDS浓缩胶缓冲液（PH=6.8）13P10164×蛋白上样缓冲液(含β-***)14P10154×蛋白上样缓冲液(含DTT)15D10701M?DTT16A103010%过硫酸氨17T10201M?Tris-HCL?(PH6.8)18T10101.5M?Tris-HCL(PH8.8)19S101010%SDS20T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液SDS如今已形成成熟的方案，实验室可根据自己的情况和习惯来选择试剂。如选择1、2、3、4、5、6、7、8、9全部试剂可自己配制。也可以选择配制好的试剂。如10、11、12、13/14、16、9、20。还可选择10、13/14、16、9、17、18、19、20。一，制胶凝胶配制表（一）　分离胶12%分离胶10%分离胶8%浓缩胶（3%）总体积10ml10ml10ml5ml4X分离胶缓冲液（PH8.8）2.5ml2.5ml2.5ml04X浓缩胶缓冲液（PH6.8）0001.2530%丙烯酰胺(29:1)4ml3.32.70.5ddH2O3.4ml4.1ml4.7ml3.2ml10%过硫酸铵100ul100ul100ul75ulTEMED10ul10ul10ul7.5ul?凝胶配制表（二）　分离胶12%分离胶10%分离胶8%浓缩胶（3%）总体积10ml10ml10ml5ml30%丙烯酰胺(29:1)4ml3.3ml2.7ml0.5ml1M?Tris-HCL?(PH6.8)0000.625ml1.5M?Tris-HCL(PH8.8)2.5ml2.5ml2.5ml010%SDS100ul100ul100ul50ulddH2O3.3ml4.0ml4.6ml3.75ml10%过硫酸铵100ul100ul100ul75ulTEMED10ul10ul10ul7.5ul常规SDS-PAGRE凝胶可按上表一或者表二配制。TEMED和10%过硫酸铵最后加，在加入前需混匀前面所加试