人尿中exosomes的分离和免疫电镜鉴定李艳艳1张渊1代义1邱峰2.DOC

人尿中exosomes的分离和免疫电镜鉴定 李艳艳1 张渊1 代义1 邱峰2 秦霞2 邱宗荫1* （重庆医科大学药学院，重庆 400016） 以超速离心分离尿的exosome1D SDS对蛋白质，超速离心分离exosomes含有丰富的蛋白信息；人尿液来源的exosome小体为脂双分子的扁平或球形小体，直径主要在 30nm-nm之间。超速离心1D SDS 1 引言 Exosomes又称外来体或外泌体，是细胞的多囊泡体(multive—sicularbody，MVB)1987年由Johnstone[1]等第一次在网织红细胞多囊泡体的胞外细胞质融合时发现。Exosomes是一种直径为30nm～0 nm的小囊泡，蛋白质脂质以及微RNA。不同细胞来源的exosome所含的蛋白质不同，其生物学功能也有所不同[]。许多细胞均能分泌exosomes，由肿瘤细胞分泌的exosomes具有瘤抗原性，可通过吸附、交联、捕捉等方法固定于树突状细胞(dendritic cell，DC)表面，提呈给细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL[3]。树突状细胞（DC）来源的exosomes（DEXs）和肿瘤细胞来源的exosomes（TEXs）因为具有抗肿瘤的作用，是目前研究的热点。其中，DEXs 临床试验正在进行中[4]。 尿液xosomes是一种低密度的固相成分，[5]，被认为携带有丰富的生物标志物信息，因此近年来受到关注[]。Trairak PisitkunLC-MS/MS的方法分析尿exosomes蛋白质组，发现了与肾脏疾病和血压调节有关的21种蛋白质，他们认为尿中exosomes是一种发现疾病标志物的良好生物标本[7]。Hua Zhou等研究报道在肾脏损伤等疾病发病过程中，exosomes含有大量的生物标记物[8]。然而，成功的分离纯度较高的exosomes是进行相关研究的基础，本exosomes进行分离提取，并通过作者简介：，重庆医科大学在读硕士研究生，电话：，E-mail：邱宗荫：*通讯作者，重庆医科大学教授电话：023E-mail：zongyin141@126.com单板夹芯式垂直电泳槽电脑三恒多用电泳仪电源L8-70M 超高速离心机（美国贝克曼公司）；PHLIPS-TECNAI 10电子显微镜igma公司）；超高速离心机（日本日立公司） 叠氮化钠（美国Sigma公司）；甘油、三乙醇胺、 40%(w/v) 丙烯酰胺/甲叉双丙稀酰胺(37.5:1)溶液四甲基乙二胺亮抑酶肽苯甲基磺酸氟胰蛋白酶测序级胰蛋白酶稀释在0.025mol/L的碳酸氢铵溶液中浓度12.5ng/μl）Bradford蛋白质定量试剂盒（上海生工公司）；兔抗人AQP-2抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；5nm胶体金标记的羊抗兔IgG二抗（武汉博士德公司）； 2.2 样品的收集、贮存和处理 尿样的来源10例健康志愿者(5男5女，年龄24-28岁，无系统性疾病，近2无用药，无吸烟史，女性不在月经周期内)的混合尿样。 尿样的采集分别于清晨采集志愿者立即加cocktail蛋白酶抑制剂1.8ml（每50ml尿中加入1.67ml的0.1mol/L NaN3；2.5ml的0.01mol/L PMSF；30μl的0.001mol/L亮）按50ml每管分装于17000×g ，4离心15分钟，以去除全细胞及大型膜碎片和其他碎片；上清液于－80贮存[]。exosomes的提取将解冻后的上清液于200000×g 4离心小时，以获得低密度沉淀物；移除上清液，加入部分上述备用上清液，于200000×g， 4 离心1小时；重复上述步骤多次，以获得低密度的exosome沉淀[]。将沉淀物重悬浮在200倍体积的溶液中（mM三乙醇胺/ pH 7.6蔗糖溶液 PMSF/1μm亮抑酶肽）。取出少量溶液用Brford法进行蛋白定量，其余的加入等体积的含有60mg/ml的缓冲液中，60 加热10分钟。分装，-80 存储备用[]。 1-D SDS 将未经离心的尿液，经17000×g离心后获取的上清液和exosomes蛋白溶液用1-D SDS进行分离，凝胶浓度为12%，上样量为20μg，经过考马斯亮蓝R-250染色后，用美国Bio-Rad公司的一维分析软件Quantity One分析 尿液来源exosome电镜分析2．5％戊二醛24 h，锇酸后固定20min，丙酮梯度脱水，环氧丙烷置换，环氧树脂Epon618包埋。包埋块修整后，制超薄切片，厚度为80 nm，分别捞片于未展支持膜的铜网和有支持膜的镍网上备用[10]。 2.5.2 包埋后免疫染色 蚀刻标本使用小片的蜡板为工作台，以下步骤均在湿盒内进行操作。向蜡板上滴加饱和过碘酸钠溶液成