电镜三维重构II.pptVIP

电镜三维重构的基本步骤 分离、纯化（包括蛋白质二维晶体的生长） 电镜样品的制备高分辨电子显微像的拍摄 样品的多角度照相 低剂量曝光技术 (Low-Dose)：聚焦和照相不在同一个样品区域 低温电镜技术：电镜中样品的温度维持在-160℃左右 像的数字化 数据处理及计算机三维重构 三维结构的解释（构建原子模型） 样品制备 负染 糖包埋 单宁酸（Tannic Acid）包埋 冰包埋 负染 原理及方法：用高电子密度的染色剂沉积在蛋白质分子周围，使蛋白质的电子显微像具有较高的反差（衬度）。 常用的负染剂：0.5 % ~ 5 % 醋酸铀 特点： 衬度好； 样品容易准备； 分辨率低，15~20 ?； 样品缩小，垂直铜网方向样品变扁平； 样品脱水影响蛋白质分子的结构 负染 糖包埋 葡萄糖与蛋白质所处的溶液介质有类似的物理和化学性质，且不易挥发。用其取代蛋白质溶液中的水介质，可使结构不受外来介质的影响。 包埋剂：葡萄糖、海藻糖 特点： 生物大分子结构不变形； 分辨率较高，理论上可达3-4? 衬度差 单宁酸（Tannic Acid）包埋 用单宁酸取代蛋白质溶液中的水介质，可使蛋白质结构稳定并保持结构不发生变化。 包埋剂：单宁酸 特点： 二维晶体的有序性保存的比较好； 分辨率较高； 衬度差 冰包埋 将样品悬液薄层迅速投入液态乙烷中，冷冻速度达到105 ℃/s以上，水结成非晶态冰，蛋白质样品处于其中。 冷台：常用液氮或液氦冷却 特点： 目前最好的样品包埋方法； 高速冷冻形成的无序冰中，样品的水合状态得以保持，样品的结构不受破坏； 可以获得高分辨率的结构数据； 可以降低样品的辐射损伤； 样品准备复杂； 衬度差，但比糖包埋好 冰包埋 单颗粒重构几种主要技术 基于模型的重构 Random Conical Tilt Angular Reconstruction 无模型的未知结构 基于模型重构流程图 挑选高分辨像 数字化 测定并消除CTF 挑选单颗粒像 模型 参考投影 测定单颗粒取向 三维重构 比对 收敛 解释 否 是 挑选单颗粒像 挑选单颗粒像 为什么比对(Alignment)？ 比对(Alignment) 比对(Alignment) 平移 旋转 取向相同的像的平均 收敛 参考投影 投影平均像 电镜三维重构现状 目前分辨率（2006/7/15） 二维晶体：3.5 ~ 1.9 ? 螺旋结构：9 ~ 4 ? 单颗：9 ~ 4.5 ? 亚细胞（Tomography）：60 ? 电镜三维重构发展趋势 分辨率 = 原子（包括晶体和非晶体样品） 动态过程 结合其它学科：生物信息学、蛋白质晶体学 自动化：样品准备、数据收集、数据处理 阅读资料 1. Bradbury, S. and Turner, G. L’E. (Eds) (1967) Historical aspects of electron microscopy. 2. Erickson, H.P. (1973) The Fourier transform of an electron micrograph: first order and second order of image formation. Adv.Opt.Elec.Microsc. (R. Barer and V.E. Cosslett, eds.) 4, 1-84 3. Hayat, M.A. (1986) Basic techniques for transmission electron microscopy. Academic Press, N.-Y. 4. Dubochet, J., Adrian,M., Chang, J.-J., Homo, J.-C., Lepault, J., McDowall, A.W., and Schultz, P. (1988) Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quat.Rev. Biophys. 21, 129-228 5. DeRosier, D.J. and Moore, P.B. (1970) Reconstruction of three-dimensional images from electron micrographs with helical symmetry. J.M.Biol. 52, 355-369. 6. Moody, M.F. (1990) Electron microscopy of biological macromolecules. In Biophysical Electron Microscopy: Basic concepts and modern techniques (P.W. Hawkes