天净沙系列CAT#:12040500低温运输和-20℃保存碱性磷酸酶牛.DOCVIP

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天净沙系列CAT#:12040500低温运输和-20℃保存碱性磷酸酶牛

天净沙系列 CAT#:120404-500 低温运输保存 碱性磷酸酶,牛小肠 Alkaline Phosphatase,Calf Intestinal 使用手册V1.0 北京天恩泽基因科技有限公司 北京市海淀区上地信息路26号北京市留学人员海淀创业园中关村创业大厦506 网址:;电话:400-6765278;电邮:order@ 产品及特点 Calf Intestinal Alkaline Phosphatase(CIAP)牛小肠碱性磷酸酶与E.coli来源的碱性磷酸酶相同,催化所有磷酸单酯的水解,不能催化磷酸二酯以及磷酸三酯的水解,对ATP等的焦磷酸键水解速度较慢。由于 CIAP 处理后的 DNA 片段缺少连接酶所要求的5′磷酸末端,因此它们不能进行自连接。这个特性可以在克隆时降低载体DNA的背景。本产品主要用于去除载体 DNA 片段的 5′-末端的磷酸基;防止克隆载体的自连接;蛋白质丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的去磷酸化; 为 5 末端标记准备模板。 规格及成分 成 份 500 U塑料袋包装 CIAP(10~30 U/μl) 120404A 500 U 10×CIAP Buffer 120404B 0.5 mL 使用手册 1份 运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期一年。 活性单位定义 在 37℃、pH9.8 的条件下,1 分钟内水解对硝基苯磷酸盐(p-nitrophenyl phosphate)生成1 μmol的对硝基苯酚(p-nitrophenol)所需要的酶量定义 为 1个活性单位(U)。 纯度 30 U的本酶和1 μg的λDNA-Hind III片段在37℃下反应16小时,DNA的电泳谱带不发生变化。 30 U的本酶和1 μg 的Closed circular(RFI)pBR322 DNA 在37℃下反应1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。 18 U的本酶和1 μg的16S,23S rRNA在37℃下反应16小时,RNA的电泳谱带不发生变化。 自备试剂 苯酚/氯仿/异戊醇, 乙醇等 使用方法 使用举例 在微量离心管中配制50 μL反应体系: 成分 加入量 DNA Fragment in TE Buffer 1~20 pmol 10× CIAP Buffer 5 μl CIAP(10~30 units/μl) 1-2 μl 补水 37℃或50℃反应30分钟。或者先37℃反应15分钟,再50℃反应15分钟。注意:单链 DNA和具有5’突出末端 的DNA在较低温度下(如37℃)即可去磷酸化,而具有3’突出末端的DNA或平末端DNA需要较高温度(如50℃)才能去磷酸化。 苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提2次。注意:如果早在苯酚抽提之前,用自备的蛋白酶K降解CIAP酶,则效果更好。具体做法是:加入EDTA和SDS使其终浓度为5 mM EDTA和0.5% SDS,最后加入蛋白酶K溶液,使其终浓度为50 μg/mL,然后56℃处理30分钟,再75℃孵育10分钟。然后用于苯酚/氯仿/异戊醇抽提。 氯仿/异戊醇(24:1)抽提1次。 添加2.5 μl的3 M NaCl(终浓度150 mM)。 添加125 μl的(2.5倍量)冷乙醇,在-20℃下放置30~60分钟。 13000g离心20分钟后,小心去上清。 用1mL 75%乙醇洗涤一次。 干甩数秒,小心吸弃上清。 用20 μl以下的TE Buffer溶解DNA沉淀待用或放-20℃长期放置。 备注 三种碱性磷酸酶对比 pNPP:p-nitrophenyl phosphate * 把各自的酶活性测定条件作为100%时研究Tris浓度的影响。 ** 在添加Buffer的条件下,比较10分钟反应时的活性影响。 *** 在反应时间内失活。 **** SAP变性处理后,用GPF切断反应确认。 关联产品 碱性磷酸酶,大肠杆菌(CAT#:120405) 碱性磷酸酶,虾(CAT#:120403)

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