TUNEL 与 ELISA 检测凋亡的方法比较.pdf

  南京碧波生物科技有限公司    TUNEL 与  ELISA 检测凋亡的方法比较  TUNEL 法   细胞凋亡中, 染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性 3‐OH 末端，可在脱氧 核糖核苷酸末端转移酶（TdT ）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性 磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3‐末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方 法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal ‐deoxynucleotidyl  transferase mediated nick end labeling, TUNEL ）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂，因而没有 3‐OH 形成，很少能够被染色。TUNEL 实际上是分子生物学与形态学相结 合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡 典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组 织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中 被广泛采用.    ELISA 法测细胞凋亡  细胞凋亡时，Ca2+,Mg2+离子依赖的内源性核酸内切酶将双链 DNA 从各核小体间连接区裂 断，产生单或寡合苷酸小体，各核小体的 DNA 与核组蛋白 H2A,H2B,H3,H4 形成紧密的复合 物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解。主要使用单克隆抗 DNA 抗体和抗 组蛋白抗体直接检测 DNA 和组蛋白。    ◆ 几种检测凋亡的方法  一、形态学观察方法  1、HE 染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表 面有“出芽”现象。  2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细 胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。  3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。 如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的 完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。  4 、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核 膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细 胞吞噬现象。  二、DNA 凝胶电泳  （一）、检测原理  细胞发生凋亡或坏死，其细胞 DNA 均发生断裂，细胞内小分子量 DNA 片断增加，高分子 DNA 减少，胞质内出现 DNA 片断。但凋亡细胞 DNA 断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现 180－200bpDNA 片断，而坏死细胞的 DNA 断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确 定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。  （二）结果判断  正常活细胞 DNA  电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞 DNA 电泳类似血抹片时的连续 性条带。  三、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定  凋亡细胞的 DNA 断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的 DNA 片断组成， 可由 ELISA 法检测。    南京碧波生物科技有限公司    （一）检测步骤  1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；  2、在微定量板上吸附组蛋白体’  3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘  4 、加辣过氧化物酶标记的抗 DNA 抗体使之与核小体上的 DNA 结合’  4 、加酶的底物，测光吸收制。  （二）用途  该法敏感性高，可检测 5*100/ml 个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不 需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。  四、流式细胞仪定量分析  （一）检测原理  细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利 用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度 来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。  （二）应用价值  流式细胞仪检测具有以下特点：  1)、检测的细胞数量螅　虼似浞从橙禾逑赴　牡蛲鲎刺　冉献既?BR2)、可以做许多相关性 分析