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Western blot 雷 萍 * 蛋白质样品经过SDS分离后，通过转移电泳或直接印迹方式原位转移至固相介质上，并保持原有的物质类型和生物学活性不变，然后应用抗原抗体反应进行的特异性检测。 Western Blot * 免疫印迹技术 一、原理 二、步骤 1、蛋白质的分离 2、转移 3、免疫学检测 * * * 1、分离 （1）制胶 1%琼脂糖封底 装配电泳槽 灌注分离胶 灌注浓缩胶 （2）样品处理 （3）电泳 2、转移 3、免疫学检测 封闭过夜 一抗37℃ 1h,洗3次 二抗37℃ 1h,洗3次 底物显色5～15分钟 ddH2O洗涤 4、结果 * 试剂原理 SDS, 巯基乙醇(2-ME)-强还原剂 AP-化学聚合的催化剂 TEMED-加速剂 以单体和双体丙烯酰胺为材料,在催化剂和加速剂作用下,聚合联接而形成的三维网状结构物质 * 浓缩胶：主要是使样品在进入分离胶前被浓缩成很窄的圆盘状，从而提高了分离的分辨程度。 分离胶：被浓缩的盘状样品区带进入此胶内，根据各组分的分子量和电荷的不同而被分开。 一 SDS分离 SDS—PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis * 10%分离胶 ddH2O 4 ml 30%丙烯酰胺 5 ml 1.5mM Tris(PH8.8) 4 ml 10%SDS 100 ul 10%过硫酸铵 100 ul TEMED 0.01ml 总计 13 ml 5%浓缩胶 ddH2O 3.4 ml 30%丙烯酰胺 1 ml 1.0mM Tris(PH6.8) 1 ml 10%SDS 50 ul 10%过硫酸铵 30 ul TEMED 5 ul 总计 5 ml * 将洗净、干燥玻璃片嵌入塑胶凹槽中。用经电极缓冲液配制的1%的琼脂糖溶液将狭缝口封住。 待琼脂糖凝固后,将玻板连同胶带凹槽安装在电泳模具上, 依次用力均匀地拎紧螺栓。 配制分离胶, 依次混合各成分,一旦加入TEMED,马上开始聚合,故应快速旋动混合物。 一. SDS混匀后,倒入玻片之间的空隙,加至离顶部约3cm处,用吸管覆加一层蒸馏水(防止氧气抑制聚合及保持界面水平)。 待20-30min后,可看到出现界面,表示已凝固。 * 配制浓缩胶, 离顶部约1cm时,即插入加样梳. 注意避免混入气泡。 约20-30min凝固。 将含有SDS、DTT的样品缓冲液与样品液(健康者血浆1:10) 1:1 混合后,沸水煮5-10min,置于冰上(防止复性),加样20ul/孔,最好在所有剩余的孔中加上等体积的1×SDS加样缓冲液。 电泳,下槽(+),上槽(-),100v, 4-5h。 * 二. 转移电泳 凝胶电泳结束前30min, 将PVDF膜先浸泡在甲醇中,再浸泡在转移缓冲液中, 在转移模具上由下至上依次放入: 若干张3mm滤纸, PVDF膜, 凝胶, 滤纸.注意:逐层驱除气泡(用玻棒或移液管)。 连接电极:膜(+),凝胶(-)。 接通电源, 20～30v,45min。 * 凝胶 PVDF膜 转移 * 三. 免疫学检测 Block:1% BSA or 5% milk in TBST, overnight. PBS-Tween 洗3次，每次5min。 Ab Incubation: HRP标记的羊抗人IgG，效价随实际调整，也可用打点法决定最佳效价。37℃,1h. 洗3次。 Develop：加入底物溶液显色5～15min, 待出现棕色条带后,用ddH2O反复洗涤，终止反应。 结果：阳性反应呈棕色条带 * * * * * * * * * * * * * *