人periostin干扰载体的构建及其对成纤维细胞目的基因表达的影响.pdfVIP

北 京 大 学 学 报 ( 医 学 版 ) JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) Vo1．42 No．5 Oct．2010 ·503 · · 论 著 · 人periostin干扰载体的构建及其对成纤维细胞 目 的基因表达的影响 刘 畅，宋振华，秦泽莲 (北京大学第三医院成形外科，北京 100191) [摘 要]目的：为了研究人成骨细胞特异因子2(periostin，POSTN)基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的影响，构建 shRNA质粒和慢病毒载体，观察其对 293T细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞的POSNT基因表达的抑制作用，检~fshRNA 慢病毒载体对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响。方法：设计特异性干扰人POSTN基 的小发卡RNA序列，合成含 有干扰序列的双链DNAoligo，与经双酶切后的质粒连接，转化感受态大肠杆菌DH5e~并对阳性克隆进行 PCR扩增 测序鉴定。将构建的质粒采用脂质体共转染人293T细胞，36～48h后采用Westernblot的方法检测 目的蛋白的表 达情况，进而判断不同靶点的干扰效果。将干扰效果最好的序列包装 shRNA质粒和慢病毒载体，利用生成的 POSTNshRNA质粒和慢病毒分别感染293T细胞和原代瘢痕疙瘩成纤维细胞，检测两种细胞 目的基因、蛋 白的表 达，进而观察基因干扰后瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖变化。结果：转染干扰质粒原代瘢痕疙瘩成纤维细胞、感染空 质粒阴性对照细胞和正常皮肤成纤维细胞的POSTNmRNA表达分别为 1．98--40．03、1．12-4-0．03和 1．08±0．03，实 验组对 比阴性对照组细胞的敲减率为43％(F=688．291，P0．001)。感染干扰慢病毒原代瘢痕疙瘩成纤维细胞、 感染空病毒阴性对照细胞和正常皮肤成纤维细胞的POSTNmRNA表达分别为 0．44--40．09、0．81±0．07和0．37± 0．05，实验组对比阴性对照组细胞的敲减率为46％(F=90．06，P0．001)。实验组 POSTN蛋白表达水平(0．29--4 0．04)比阴性对照组细胞(0．53,4-0．09)的表达降低 45％(F=33．43，P0．001)，正常皮肤成纤维细胞POSTN蛋白 的表达水平为0．234-0．02。感染干扰质粒和慢病毒的原代瘢痕疙瘩成纤维细胞与空质粒转染的对照细胞相比， POSTN蛋白和mRNA的表达水平亦明显降低 ，并趋近正常皮肤成纤维细胞的表达。从感染慢病毒48h开始，干扰 组瘢痕疙瘩成纤维细胞与空质粒转染 的对照组细胞相 比增殖明显减慢，抑制率达 19％。结论：本方法构建的 POSTN基因干扰质粒和慢病毒构建成功，其能显著降低POSTN基因和蛋白在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达，干扰 POSTN基因表达抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖。POSTN基因干扰质粒和慢病毒的构建成功为进一步研究 POSTN基因的功能奠定了研究基础。 [关键词]periostin；成纤维细胞 ；RNA干扰；瘢痕疙瘩；慢病毒属 [中图分类号]R34 [文献标识码]A [文章编号]1671—167X(2010)05-0503-06 doi：10．3969／j．issn．1671—167X．2010．05．003 Constructi0nOfperiosfinshRNA vectorsandtheireffectsontheexpressionofperios． tin in fibroblasts LIUChang，SONGZhen-hua，QINZe—lian (DepartmentofPlasticSurgery，PekingUniversityThirdHospital，Beijing100191，China) ABSTRACT Ob．iective：Forstudingthefunctionsofperiostin(POSTN)further，therecombinantplasmid andlentiviralvectorforhumanperiostinwereconstrcted．ThemRNA andproteinexpressionsofPOSTN weretestedaftertheinfectionwiththeshRNA plasmidandlentivirusofP0STN inprimarykeloidfibro— bl