发酵工艺学菌种选育（一）.pptVIP

基因工程技术育种的设计 技术：提高限速酶的活力，解除抗生素生物合成中的限速步骤，改变细胞内代谢流的方向，提高抗生素的产量。 引入抗性基因和调节基因，引入氧结合蛋白来提高抗生素的产量 增强正调控或解除负调控基因的阻遏 敲除或破坏次要组分的生物合成基因来消除或减少次要组分 1.1增加抗性基因拷贝数，提高产生菌自身耐受性 增加生物合成限速阶段酶系基因剂量有可能提高抗生素的产量。 泰乐菌素最后一步是大菌素在O-甲基转移酶催化下转化为泰乐菌素。发现高产弗氏链霉菌的O-甲基转移酶活性高，并且积累大量大菌素，通过克隆O-甲基转移酶可提高产量。 小　结 1. 掌握菌种选育的概念和原理。 2．掌握自然选育、诱变育种的主要环节。 3．熟悉诱变育种的筛选方法，理解并掌握理化性筛选方法。 淘汰野生型 抗生素法：由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，在MM中一定量的抗生素，杀死活化状态的野生型，保存了休眠状态的缺陷型 细菌－青霉素，酵母－制霉菌素 菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过 检出缺陷型 原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。 具体方法：影印法、点种法、夹层法 生长谱测定的方法 　　　将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50℃)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的5-6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。一个平皿测一个菌。 　　　以不同组合的营养混合物与融化凉至50℃的MM培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子。在5－6个平皿上可测20株菌以上。 (2)筛选抗反馈调节突变株 筛选结构类似物抗性突变株 结构类似物：结构与代谢产物类似的化合物 特点：有反馈调节作用 无正常生理功能 筛选方法：浓度梯度法（补充） 利用回复突变筛选抗反馈突变菌株 诱变育种实例： 赖氨酸高产菌株选育 天冬氨酸 黄色短杆菌的代谢过程 甲硫氨酸 苏氨酸 赖氨酸 天冬氨酸磷酸 天冬氨酸激酶 天冬氨酸β－半醛 抑制 高丝氨酸 高丝氨酸 脱氢酶(HD) 黄色短杆菌的代谢特点 天冬氨酸激酶（AK），是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受Lys（赖氨酸）、Thr（苏氨酸）的协同反馈抑制 协同反馈抑制：该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合，但是并不影响该酶的活性，只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后，其活性才受到抑制。 两个分支点的优先合成机制 ： 优先合成高丝氨酸Hos，再优先合成蛋氨酸Met 当Met过量时 阻遏琥珀酰高丝氨酸合成酶，使代谢流向合成Thr的方向进行 当Thr过量时 反馈抑制高丝氨酸脱氢酶，使代谢流向Lys的合成上。 （Met＞Thr＞Lys） 天冬氨酰磷酸 天冬氨酸-β-半醛 高丝氨酸 高丝氨酸磷酸 O-琥珀酸高丝氨酸 二氢吡啶-2,6-二羧酸 赖氨酸 苏氨酸 蛋氨酸 天冬氨酸 育种途径 切断或减弱代谢支路 切断或减弱合成Met 、Thr的分支途径——选育营养缺陷型突变株 可选用Hos-，其意义在于： 解除了Hos的优先合成机制，阻断了代谢向Met、Thr的方向进行，节省了原料，可以使Asp-β-半醛这个中间代谢产物全部转入Lys的生物合成上。 在培养基中限量的供给Met 、Thr（或者Hos），对于AK酶活性的调节有着重要意义。 因为AK酶是一个协同反馈抑制的变构酶，限制了其中某一个抑制物（Thr），则Lys的浓度再高，也不会影响到AK酶的活性，那么，代谢一直向着赖氨酸合成的方向进行，使得产物的合成畅通无阻。 　　　双重营养缺陷型突变株（Met- + Thr-）,其本质和Hos- 相同。 　　　优点：遗传性质稳定，回复突变的几率少。 天冬氨酸 人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸 中间产物Ⅰ 天冬氨酸激酶 中间产物Ⅱ 甲硫氨酸 苏氨酸 高丝氨酸 高丝氨酸 脱氢酶 不能合成 可以大量积累 赖 氨 酸 人工诱变的 菌种不能产生 解除反馈调节（—反馈阻抑） 从理论上讲，选育Hom- 进行赖氨酸发酵，如果在其培养基中限量供给Thr，则AK酶的活性不会受到Lys的反馈抑制，实际上Lys对AK酶的活性存在一定的抑制作用。因此，对于黄色短杆菌的Lys发酵，仅仅选育Hom- 是不够的。为了高效率的转化Lys，