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蛋白质纯化实验室 实验手册 祁超 2007年10月 外源基因在大肠杆菌中的表达 一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上 （一）PCR引物设计的基本原则与PCR反应组分和条件 PCR引物设计的基本原则 （1）引物与靶基因间配对的碱基一般为15-20。 （2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G + C含量宜在45-55%左右。 （3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3’末端不应有互补链存在。 （4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。可用计算机进行辅助检索分析。 （5）引物3’末端一般以单个C或G结尾。 PCR反应组分和条件 PCR反应体系一般选用50 μl体积，其中含有： 10×Reaction buffer，5 μl 2个引物，各12.5-25 pmol (终浓度各0.25-0.50 μmol/L) 4种底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各200μmol/L 模板DNA，100 ng左右 Taq DNA聚合酶，2.5-3 U PCR反应条件一般为： （1）94℃，5分钟 （2）94℃变性30-60秒 （3）50-55℃退火30-60秒 （4）70-72℃延伸30-60秒 （5）72℃5-10分钟 共进行25-35次循环。循环是步骤（2）和（4） 质粒DNA的小量制备 1、传统方法 （1）用灭菌牙签挑单菌落于3 ml LB培养液中，37℃培养过夜。 （2）在每个EP管中倒入1 ml 左右的过夜培养物，6,000 rpm 离心1分钟以收集菌体。 （3）将菌体重悬于100 μl 4℃预冷的溶液I中，并加入200 μl新配制的溶液II, 盖紧管口，快速颠倒离心管6-7次，然后，冰浴5分钟。 （4）加150 μl 4℃预冷的溶液III, 倒置5-6次以混合内容物，然后，冰浴5分钟。 （5）12,000 rpm 离心10分钟后，小心吸取上清至另一EP管中。 （6）加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置5分钟。 （7）12,000 rpm离心5分钟后，移去上清，并用70%乙醇漂洗DNA沉淀。DNA沉淀自然干燥，并溶于20 μl 双蒸水或1×TE缓冲液 (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。 2. Promega公司Wizard Plus小量DNA纯化方法-离心方案（适用于产品A1330，A1340，A1460及A1470） （1）12,000 rpm离心1分钟，以沉淀1-10 ml过夜培养物。 （2）用250μl Cell Resuspension Solution充分悬浮大肠杆菌细胞。 （3）加250μl Cell Lysis Solution，倒置5-6次混合。 （4）加10μl Alkaline Protease Solution，倒置5-6次混合，室温放置5分钟。 （5）加350μl Neutralization Solution，倒置5-6次混合。 （6）室温，最高转速离心10分钟，回收上清。 （7）将离心柱插入收集管中。 （8）将上清倒入离心柱中。 （9）室温，最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。 （10）μl Wash Solution（加乙醇），最高转速离心1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。 （11）重复步骤（10）（用250μl Wash Solution）μl Nuclease-Free Water，室温，最高转速离心1分钟。 （15）DNA溶液保存在-20℃备用。 (三) 质粒DNA的中量制备 1. 在100 ml 含100 μg/ml 氨苄青霉素的LB培养液中加入1 ml pET-15b/Novablue甘油菌，37℃培养过夜； 2. 4℃, 4,000 rpm离心10分钟以收集菌体；在菌体用3 ml 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, pH 8.0) 充分悬浮后，加入6 ml 溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1% SDS)，并倒置混合，冰浴5-10分钟； 3. 加入4.5 ml 溶液III（60ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml 冰乙酸和28.5ml水），轻摇混合，冰浴10分钟； 4. 4℃，12,000 rpm 离心20分钟，小心吸取上清至另一个50 ml离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟； 5. 室温，10,000 rpm离心10分钟以沉淀DNA； 6. 在沉淀用70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于0.3 ml 的TE (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 缓冲液中，然后