CR2DAF和DAFCR2靶向补体抑制物的构建、 表达与鉴定.doc

　　CR2DAF和DAFCR2靶向补体抑制物的构建、 表达与鉴定 ：贾雷立, 马巍娜, 宋宏彬, 刘雪林, 董世存, 张传福, 孙走南, 钟彦伟 【摘要】 　　目的: 构建针对补体激活物的特异靶向补体抑制物, 并对其进行体外活性鉴定。方法: 将补体受体（CR2）与补体抑制物（促衰变因子, DAF）以融合表达方式（顺反结构）克隆到表达载体PBM中, 然后将重组体转移到CHO细胞中进行蛋白表达, 用SDSPAGE、 ）检测、 SPR检测及补体介导的细胞溶解实验对表达的融合蛋白进行生物学活性鉴定。结果: SDSPAGE和与SPR检测结果显示, 重组蛋白CR2DAF与DAFCR2能特异地与C3包被的CHO细胞、 C3dg配基相结合。补体介导的细胞溶解实验结果显示, 靶向补体抑制物比相应的非靶向补体抑制物的抑制效果明显（CR2DAF的抑制效率高达20倍）。结论: 成功构建了CR2DAF和DAFCR2靶向补体抑制物, 为下一步进行动物体内补体抑制实验奠定了基础。 【关键词】 CR2 促衰变因子 补体 抑制物 　　补体是机体免疫系统的重要组成部分, 补体活化在机体抵抗微生物方面发挥着重要作用, 但在特定条件下它可以对宿主自身产生危害, 过度的补体活化在免疫复合物疾病和自身免疫综合征中发挥作用。干预这种不需要的补体活化是补体研究中的长期目标, 近年来取得了一定的进展, 如通过重组产生的补体调控蛋白（可溶性CR1）或人源化的抗C5 单克隆抗体(mAb), 已在临床上取得明显 治疗 效果[1, 2]。但CR1在抑制补体活化的同时也阻断了机体免疫系统中C3活化产物的产生, 从而存在一定的副作用。近年来, 人可溶性促衰变因子（decay accelerating factor, DAF）作为补体抑制物在炎症和生物不相容性疾病动物模型中体现出了一定的保护作用[3, 4]。直接将靶向补体抑制物定位至补体相关疾病位点的策略可能提高对补体的抑制效率, 同时可以避免由于系统性和长期性补体抑制带来的副作用。已有研究表明, 抗体DAF靶向融合蛋白比非靶向补体抑制物能更有效保护目标细胞[5]。C3激活片段是存在于补体激活位点处的调理素, 它们是不同C3受体的配基。CR2是C3的一个受体, 主要表达在B细胞和滤泡树突细胞上[6], 它在体液免疫中起着重要的作用。CR2由15或16个短同源重复序列（short consensus repeat, SCR）组成, 其天然配基是iC3b, C3dg和C3d[7]。这些配基一旦产生, 不仅能存活相对较长的时间, 而且在补体激活位点的浓度也较高[3]。因此, 拟采用可溶性CR2作为将DAF定位至补体相关疾病位置的载体, 从而构建一种更有效的靶向补体抑制物, 使其只对补体激活位点产生抑制,而不影响机体免疫系统正常的补体调节。 　　 1 材料和方法 　　1.1 材料 表达载体PBM于缺失鼠IgG1 Fc编码区的p118m IgG1; CHO细胞用于蛋白表达, 其培养液为含100 mL/L胎牛血清的DMEM, 购自Invitrogen公司。鼠抗DAF mAb 1H4和1A10、 鼠抗人CR2 mAb 171、 抗羊红细胞IgM及所有二抗均购自Sigma公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 兔抗CHO细胞膜和人DAF的抗血清的制备 按照 参考 文献 [8]介绍的方法获得。 　　1.2.2 表达重组体的构建及蛋白表达 cDNA结构基因由编码CR2的4个N端SCR单位与编码DAF编码胞外区的序列相连接而成。补体抑制物序列是编码成熟DAF蛋白序列的1-249个碱基（SAb（1H4）与HiTrap正常人血清（normal human serum, NHS）活化的亲和柱偶联而成。将含重组蛋白培养上清的pH值调至8.0, 以0.5 mL/min的速率过柱。然后以6～8倍体积PBS洗柱子, 重组蛋白以2～3倍柱体积的0.1 mol/L甘氨酸（pH2.4）洗脱。将融合蛋白收集到1 mol/L Tris缓冲液（pH8.0）中, 并在PBS中透析。 　　1.2.4 SDSPAGE和检测 CHO细胞在含100 mL/L抗CHO血清的培养液中培养, 用C3调理。在100 g/L C6depleted NHS中37℃作用45 min。经C3调理的CHO细胞用1 μmol/L的重组蛋白在4℃条件下进行洗涤、 孵育60 min。之后用10 g/L的抗DAF的mAb 1H4在4℃条件下孵育30 min。用FITC标记的二抗（1∶100） 4℃条件下孵育30 min。之后用含20 g/L多聚甲醛的PBS溶液进行洗涤、 固定。最后用FCM进行检测分析。所有的孵育与洗涤均在DMEM中进行。C3致敏结果用人iC3b特异性抗体进行F